如何在肿瘤耐药性研究中杀出条生路

点击上面蓝字↑↑↑ 　　临床上肿瘤耐药性的形成是治疗癌症的一个主要的障碍，从小菜鸟到大牛纷纷想冲上前线一举攻克之，然而肿瘤耐药性怎么下手？怎么研究才能发高分？今天加菲猫就拿CancrCll（IF=23.）的一篇文章举例，看看人家是怎么从肿瘤微环境的角度研究肿瘤耐药的！（查看文献原文请回复关键字：）

　　间充质干细胞（MSCs）是具有多向分化能力（脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞等等）的多能干细胞，是近年来肿瘤微环境中研究的热点。MSCs在人体中分布比较广泛，在损伤组织中尤其多：旁分泌信号通路会诱导MSCs募集于损伤组织。研究发现，在肿瘤发展期，肿瘤细胞通过激活旁分泌募集大量MSCs，通过MSCs分泌的大量生长因子和细胞因子，促进自身增殖，血管生成，以及转移。

　　本文的研究人员利用的是小鼠模型：在带有皮下移植瘤的小鼠中静脉注射带有GFP标记的MSCs，发现只有肿瘤组织中有这些被标记的MSCs，其他组织没有，而MSCs在肿瘤组织中的富集并不影响肿瘤的生长。（成功构建了一个很好的研究耐药的模型）

　　本文提出并解决的问题：MSCs是否与肿瘤化疗耐受有关？作用机制是什么？

预告本研究亮点：

发现MSCs诱导顺铂耐药的作用方式和途径，通过3种肿瘤细胞、2种动物模型，多重反复验证，实验思路非常清晰和严谨；

本研究的发现具有实际的临床指导意义：在使用顺铂治疗肿瘤时，需要避免同时食用含有HHT、16:4(n-3)成分的食物、保健品、药物等。

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我们来看看实验结果吧！

1.MSCs诱导耐药性　

　　作者使用的药物研究经常使用的顺铂。用结肠癌和肺癌这两种细胞分别在两种小鼠模型中进行了MSC静脉注射以及顺铂腹腔给药后发现，顺铂对这两种细胞都有增殖抑制作用，BUT，MSC可以诱导耐药性，且耐药性的强弱与MSC有剂量关系。

　　作者排除了耐药性与肿瘤大小的关系，同时，皮下注射MSC同样能引起移植瘤的耐药性，而且所需要的MSC量更少。说明MSC的作用方式可能不是通过细胞直接作用的。

目前报道MSC的作用方式主要有两种：

通过直接的细胞相互作用

通过旁分泌和系统分泌分泌多种生长因子和细胞因子

　　为了得出更进一步的结论，作者用体外培养的顺铂处理MSC细胞的上清（CM+），代替MSC进行皮下注射小鼠。同样也用两种细胞，结果也如预料一样，CM+能明显引起移植瘤对顺铂的耐药。说明，MSC诱导肿瘤细胞耐药不是通过直接的细胞作用，而是通过分泌一些因子实现的。而没有顺铂处理的MSC上清（CM-）没有促进肿瘤耐受顺铂的作用（图E），说明顺铂能够刺激MSC，使其分泌一些因子，促进肿瘤细胞对顺铂耐受。

2.只有具有分化潜能的间质细胞才能被铂类化疗药激发，分泌耐药因子。

　　接着作者要确定MSC诱导的耐药性是不是对所有的化疗药。作者分别用奥沙利铂、卡铂、5-氟尿嘧啶、伊立替康代替顺铂，重复了上述MSC和CM实验，发现，只有铂类药物能激发MSC诱导耐药。

　　那如果反过来，铂类激发MSC诱导的耐药是不是对其他化疗药也有效呢？图C实验结果表明，顺铂处理MSC的上清能够诱导移植瘤对5-氟尿嘧啶以及伊立替康的耐药性。

　　作者用顺铂处理移植瘤小鼠，30分钟后他收集这些小鼠循环系统中的MSC，然后皮下注射到另外的有移植瘤的小鼠里，同时用伊立替康处理，发现小鼠出现明显的耐药性。说明，循环系统中的MSC也能被铂类化疗药激发，诱导肿瘤产生耐药性。

　　是不是只有MSC才能够被铂类化疗药激发诱导肿瘤产生耐药性呢？作者用了其他细胞系进行实验后表明，造血干细胞和成熟的造血细胞不行，而不同分化程度的MSC中，也只有鼠胚胎成纤维母细胞（MEF）有这个功能，其他分化程度的细胞均不能诱导耐药性。这个结果表明：只有具有分化潜能的间质细胞才能被铂类化疗药激发，分泌耐药因子。

3.耐药性是通过间接、可逆的预防细胞凋亡产生的

　　作者发现CM+必须在顺铂处理小鼠3个小时内注射进体内才有效，并且，如果一周后如果不再注射CM+，小鼠的耐药性消失。说明，MSC分泌的耐药因子只作用于顺铂作用的前期，而且它没有从本质上让肿瘤细胞产生耐药性。但是，caspas-3阳性的细胞的凋亡减少了一半。BrdU染色显示，细胞的增殖能力没有受到影响。

　　但是如果CM+和直接从小鼠中获得的血清混合再作用于肿瘤细胞，没有耐药性产生。因此作者排除了血清中原本存在的某些因子能辅助MSC诱导耐药的可能但是可以肯定的说，CM+中肯定存在着某个成分，可以诱导小鼠产生耐药性，这个成分可能是先诱导血清产生某种物质，然后这种物质再诱导肿瘤细胞产生耐药。

4.游离脂肪酸是引起耐药性的主要成分

　　因此，作者用系统代谢组学的方法研究CM中的各种成分对小鼠耐药性的影响。通过逐级分离，发现成分B：游离脂肪酸就是引起耐药性的主要成分。图C是从CM+和CM-中分离出来的B成分对肿瘤耐药性的影响，可以看到，只有被顺铂诱导处理过的CM+分离出来的B成分能诱导肿瘤细胞产生耐药性。

　　根据饱和度，B成分又被分为5种成分，成分3和5都能引起耐药性。综合色谱、元素分析以及质谱分析结果得出，成分3是图E的12-酮-5,8,10丙烯17酸（KHT）；而成分5有3种成分，分别是成分3中有的KHT和图F的4,7,10,13-丁烯16酸（16:4(n-3)），以及还有一种未能得出结构式的不明脂肪酸。

　　研究发现，KHT和16:4(n-3)这两个脂肪酸单独使用时不影响肿瘤生长，但是与顺铂联用时，它们都能单独诱导体内肿瘤细胞产生耐药性，而其他对照脂肪酸却没有这个效果。

5.MSC诱导的耐药性可以被COX-1抑制剂所阻遏 　　

　　细胞在应对外界刺激的时候，胞内钙浓度会升高，磷脂酶PLA2，PLC被磷酸化，胞膜释放omga3和6脂肪酸，如EPA（十二碳五烯酸），AA（花生四烯酸）。在胞内，这些脂肪酸随后会通过COX途径转化为前列腺素，白细胞三烯等，或者经过TXAS途径转化为血栓烷A。据报道，KHT是血栓烷A的副产物，而16:4(n-3)是十二碳五烯酸EPA过氧化产物，作者假设，它也跟以上两个途径有关系。既然这两个脂肪酸是这两个途径的下游产物，那么，抑制这个途径，是不是就能阻止顺铂处理的MSC诱导的肿瘤细胞耐药性的产生呢？作者选择了这条途径的相关抑制剂，包括磷脂酶的抑制剂，钙离子螯合物，钙泵抑制剂，COX抑制剂以及TXAS抑制剂进行实验。结果如下：

　　只有COX抑制剂，PLA2，TXAS抑制剂以及钙离子螯合物，能够恢复细胞对顺铂的敏感性。体内实验也表明，在化疗之前，给小鼠静脉注射MSC和COX（indomthacin）或TXAS抑制剂（ozagrl），体内的肿瘤细胞就不能对顺铂耐受了。

　　KHT和16:4(n-3)对肿瘤细胞对化疗药的敏感性有关键作用。COX和TXAS抑制剂是通过抑制MSC产生KHT和16:4(n-3)这两种氨基酸，从而达到恢复细胞对化疗药的敏感。

　　到这里为止，作者已经可以得出结论：顺铂能够刺激MSCs分泌KHT和16:4(n-3)，这两种脂肪酸能够诱导肿瘤细胞耐药。COX或TXAS抑制剂阻断它们的合成，能够抑制其诱导肿瘤细胞耐药的过程。

　　接下来是临床的实验数据：

6.乳腺癌异种移植模型中的验证

　　从健康人的骨髓中分离得到的MSC静脉注射进在皮下接种的裸鼠中的实验结果。可以看到，跟之前用鼠MSC的实验结果一致，人MSC在顺铂刺激下，同样能够诱导肿瘤细胞产生耐药性。而且持续给药持续耐药。

　　同样，人MSC的CM+也能诱导肿瘤细胞产生耐药。

　　作者检测了10例用铂类化疗药治疗的食道癌病人以及10例没有用铂类化疗药治疗的乳腺癌病人的血清样品，发现，接受铂类化疗的病人的血清中，16:4(n-3)的含量明显比接受非铂类化疗的病人高。表明，作者的研究结论适用于临床研究。

7.海藻提取物和商用鱼油产品诱导抗化疗

　　脂肪酸普遍存在于各种常见的食物中，作者也发现在商品化的鱼油和藻类提取物中，16:4(n-3)的含量非常丰富。而鱼油由于其丰富的保健功能以及抗癌功效，经常被癌症病人使用。为了研究鱼油是否对铂类耐药的产生有促进作用，作者给接种了肿瘤细胞的小鼠分别口服提纯的HHT、16:4(n-3)以及鱼油。结果表明，口服HHT、16:4(n-3)能使小鼠产生耐药。口服鱼油以及海藻提取物的小鼠则产生明显的耐药。这些结果进一步证明，这些脂肪酸对临床耐药性的影响。

本研究残留的疑问：

为何在体外，MSC共培养或者添加CM+不能引起C26细胞耐药？

对于KHT、16:4(n-3)如何引起肿瘤多药耐药？

顺铂是如何诱导MSC分泌KHT、16:4(n-3)？为何其他药物没有这个作用？

　　这些疑问给后续研究提供了方向，小伙伴们看看自己有可以下手的地方不？

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掌握肿瘤数据库(TCGA、COSMIC、On 　　解螺旋特约专家，具有12年生物医学科研经历的海归博士，具有丰富的生物医学背景。在Natur、NaturGntics、NaturCommunication、BMJ和Bioinformatics等国际知名杂志发表论文60余篇，总影响因子，总引用次数。担任多本知名SCI杂志审稿人。

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