技术普及谈一谈石墨烯在生物医用方面的

石墨烯联盟CGIA

　　石墨烯作为一种新型的二维碳纳米材料，因其具有特殊结构以及物理和化学性能，成为近年来国际科学研究的热点。之前我们也给大家多次解读过关于石墨烯的基础信息和应用，但某个领域的应用我们很少 　　石墨烯是由碳原子以sp2杂化连接形成的单原子层二维自由态原子晶体，它具有碳六元环组成的二维周期蜂窝状点阵结构，它是目前世界上最薄却又是最坚硬的二维纳米材料，其厚度仅为0.35nm，由于石墨烯具有高导热性、高弹性和机械强度、超强的薪附性、大的比表面积以及独特的载流子特性，使其在电子器件、复合材料、储能材料等领域得到广泛的研究，并取得一定的科学进展。除此之外，石墨烯及其衍生物氧化石墨烯和其它功能化的石墨烯还具有比较好的生物相容性，在医用领域具有潜在的应用前景。

　　石墨烯在生物传感器中的应用

　　年以来，基于石墨烯生物传感器的研究逐年增多，也越来越接近于实用化。研究发现，ssDNA上的核背酸碱基能够很强地绑定到石墨烯的表面，通过π-π堆垛，并将其用来研究新型的基于石墨烯的DNA检测平台。年，Mohanty等首次成功地设计了石墨烯电子器件来探测细菌、DNA和蛋白。还可以将寡核苷酸(如分子信标和核酸适配体)递送到活细胞中用来检测生物分子。

　　纳米石墨烯修饰的电极可用于检测各种生物大分子，包括葡萄糖、蛋白和DNA等，而且灵敏度非常高，这主要是由于纳米石墨烯具超高的比表面积和卓越的电子迁移率。研究发现，复合纳米材料具有非常好的非酶生物传感行为，其中灵敏度为.52μA·mM-11·cm-2，葡萄糖的检测极限为。.69μM(S/N=3)，工作电压为+0.7V时的线性范围是2.79μM~2.03mM，具有潜在的临床应用价值。众多的基于纳米石墨烯的生物传感器的研究指出了这种新型传感器的一些优势。

DNA传感机制原理图

　　石墨烯在组织工程中的应用

　　由于纳米石墨烯及其衍生物具有独特的机械性能(如高弹性、柔性、超强黏附性、良好可塑性)、优异的导电性以及氧化石墨烯优异的生物相容性，纳米石墨烯及其衍生物在组织工程、再生医学和干细胞工程领域的研究取得一定的进展。

　　壳聚糖（CS）被广泛用作生物支架材料，可以引导和促进骨组织的形成，但壳聚糖支架机械强度太低，应用受到很大限制。Fan等制备了石墨烯(G)/壳聚糖(CS)复合薄膜，其中添加石墨烯的量是壳聚糖的0.1%~0.3%(wt)，结果显示，壳聚糖的弹性模量增加了约%，同时细胞薪附实验证明，鼠纤维肉瘤细胞L可以很好地薪附生长。虽然G/CS复合薄膜没有明显的细胞毒性，但是随着石墨烯含量的不同，这种复合薄膜诱导细胞形态发生不同的变化。 　　

　　Depan等通过将CS的氨基和氧化石墨烯(GO)的竣基共价结合制备了GO-CS水凝胶支架，这种支架能够明显提高鼠前成骨细胞MC3T3-E1的薪附、增殖、分化和磷酸盐的矿化沉积。Misra等研究了纳米结构的UO-CS复合支架与蛋白吸附和成骨细胞反应之间的相互作用，揭示了结构和功能的关系，结果证明GO的纳米结构与蛋白吸附特性协同促进了MC3T3-E1的钻附、增殖和活性。

　　除了壳聚糖之外，石墨烯同样可以和其它材料(如PVA、PMMA和PPC)复合，提高支架的机械性能和生物相容性。Lalwani等比较了氧化石墨烯纳米片(GONPs)、单壁和多壁氧化石墨烯纳米带(SWGONRs,MWGONRs)以及二硫化钥纳米片(MSNPs)加人对聚丙烯延胡索酸醋(PPF)机械强度的增强效果。结果证明，PPF机械强度增加与材料的纳米结构密切相关，二维的GONPs效果最好，二维的GONPs作为一种超高机械强度和超轻的新型生物材料有望用到骨组织工程。Liao等利用甲基丙烯酸化的硫酸软骨素(CSMA)聚(乙二醇)甲基醚一己内醋丙烯酸氯(MPEG-PCL-AC,PECA)以及氧化石墨烯，制备出可降解的多孔支架，该复合材料支架具有很好的生物相容性，动物实验显示受损软骨处有较厚的新的软骨生成。

　　石墨烯应用的另一个重要领域是与组织工程和再生医学密切相关的干细胞工程。Lee等研究发现，与PDMS基底相比，间充质干细胞(MSCs)在石墨烯(G)和氧化石墨烯(GO)基底上更容易增殖。同时发现，G基底更容易诱导MSCs向成骨分化和矿化，因为G表面高水平地沉积地塞米松。相反GO基底更容易诱导MSCs向脂肪细胞分化，因为GO表面可以更高水平地结合胰岛素。这种差别主要是基于G和GO不同程度的π-π堆垛、静电作用和氢键调谐。因此，G和GO在骨组织工程有广阔的应用前景。

　　纳米石墨烯及其衍生物在组织工程领域的研究还处在起步阶段，尤其是体内生物学评价、不可降解性能及其在体内的毒副作用还有待进一步的系统性研究。初步研究表明，石墨烯及其衍生物经静脉注射，腹腔注射，日服之后主要沉积在内皮网状系统，肝脏和脾脏，虽然在体内滞留的时间较长，最后经肾脏和粪便排出体外，对动物体的毒性微乎其微。但是G、GO和rGO能够提高生物支架的机械强度，有利于细胞的钻附、生长、增殖和分化，说明纳米石墨烯在组织工程领域有很好应用前景。

　　石墨烯的生物安全性和生物降解

　　石墨烯及其衍生物在生物医用领域的应用前景很好，但在生物体内的安全性有待进一步的系统、深人性的研究，因此生物安全性和生物降解研究就显得非常重要，直接关系到石墨烯由实验室走向临床的关键要素。

　　石墨烯(G)和未经修饰的氧化石墨烯(GO)对细胞有一定的毒性且有浓度依赖性，并且石墨烯(G)的毒性高于氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO)，其细胞毒性作用机制包括细胞膜的损伤、ROS的产生以及与凋亡相关的基因表达水平的改变，但是氧化石墨烯经大分子(如壳聚糖、聚乙二醇、葡萄聚糖、过氧化物酶和蛋白等)进行表面修饰后，只展现出非常低的细胞毒效应。Liu等研究了功能化的纳米氧化石墨烯在小鼠体内的分布和毒性，而且他们还研究了日服和腹腔注射两种给药途径的毒性差别。

　　研究发现，PEG-GO经小鼠日服之后没有明显的组织吸收，说明日服之后PEG-GO很快被排除体外；而经腹腔注射之后在小鼠的脾脏和肝脏发现PEG-GO的积累，经器官切片和血液分析发现，虽然腹腔注射PEG-GO之后在小鼠体内长时间的滞留，但是其毒性是微不足道的。

　　生物降解也是医用材料研究的一个重要方面。年，Kotchey等研究发现氧化石墨烯(GO)可以通过酶催氧化的方式发生生物降解，而还原氧化石墨烯(rG0)不能被降解。将GO片跟辣根过氧化物酶(HRP)和40μM的过氧化氢作用后，发现随着作用时间的延长，GO片先是出现褶皱，后出现孔，孔随着时间的延长进一步增大，12天时出现GO的碎片，20天时GO片仅剩少量残余。通过气相色谱一质谱分析法(GC-MS)，证明了GO氧化催化的最终产物是CO2。

　　石墨烯在疾病诊断中的应用

　　石墨烯在疾病诊断中的应用研究十分广泛，几种人类肿瘤在完整的三竣酸酶的存在下能够解偶联线粒体ATP的产生，首次利用氧化石墨烯荧光共振能力转移的功能实现实时监测ATP的产生。Fan等联合纳米石墨烯片和硒化福量子点探测肝癌的生物标记物α-胎蛋白(AFP)，这种免疫荧光检测方法是基于纳米石墨烯片作为荧光受体，而硒化福量子点作为能量的供体。

　　Wang等研究发现，氧化石墨烯和肤的结合可以用作细胞内蛋白酶传感器，检测细胞内Caspase-3的活化，检测极限为7.25ng·mL-1，凋亡是细胞的程序性死亡与众多疾病密切相关，包括肿瘤、自身免疫疾病、心力衰竭和神经系统退变性疾病等，而Caspase-3在细胞发生凋亡的开始和进程中均发挥着核心作用口。此外，Gu等利用竣基化氧化石墨烯修饰的光寻址电位传感器(LAPS)无标记检测前列癌循环肿瘤细胞(CTCs),1mL血中能检测到10个循环肿瘤细胞，该检测系统具有非常高的特异性和灵敏度。通过循环肿瘤细胞检测可以预测肿瘤反应和病人的存活率，被用作临床决策的潜在的生物标记。

氧化石墨烯与多肽连接检测凋亡蛋白Caspase-3的活化

　　纳米石墨烯在药物和基因载体中的应用

　　氧化石墨烯独特的Sp2杂化连接形成的二维周期蜂窝状点阵结构不仅对药物或基因有一定的吸附和缓释作用，而且丰富的含氧(如竣基、轻基)基团可以结合一定的缓释或与基因作用的基团或分子，在具有良好生物相容性和稳定性的同时，负载药物和基因，是一种理想的纳米载体，可以有效地递送药物和基因。

　　年，Dai课题组首次报道了纳米氧化石墨烯经聚乙二醇(PEG)修饰之后可以将不溶解的芳香类抗癌药物递送到细胞内。首次获得了l0nm~50nm的氧化石墨烯纳米片（NGO），将端氨基PEG接树枝到NGO上，通过π-π堆垛有效地负载不溶芳香类抗癌药物喜树碱衍生物SN38。因石墨烯超大的表面积，使得NGO-PEG复合物具有超高的载药效率。研究结果发现，NGO-PEG-SN38对结肠肿瘤细胞HCT-具有很高的细胞毒性，对此肿瘤细胞的杀伤效果很好。基于NGO的靶向给药体系，将B细胞单克隆抗体(Rituxan,CD20+antibody)与NGO-PEG化学交联，并将CD20-NGO-PEG与阿霉素(DOX)在溶液中(pH=8)孵育过夜，阿霉素通过二堆垛负载到NGO上，结果表明CD20-NGO-PEG-DOX复合物对表达CD20的B淋巴瘤细胞具有靶向杀伤性。这项工作进一步研究了DOX从NGO上的缓释呈pH依赖性。

　　近年来的研究工作主要是通过高分子材料或组织工程中常用的生物材料(如聚乙二醇(PEG)以及生物分子等修饰氧化石墨烯后用作药物载体，达到高效载药、缓释和靶向给药的效果。Oh等利用胆甾醇基透明质酸(CHA)修饰还原氧化石墨烯纳米片(rGO)，与单纯的rGO纳米片相比，CHA-rGO纳米片生理溶液中具有更好的胶体稳定性和生物安全性，静脉注射CHA-rGO浓度为40mg/kgCHA-rG0纳米片到小鼠体内，存活率为%。CHA-rGO纳米片负载阿霉素DOX的量是单纯rGO纳米载药量的4倍。这种基于CHA-rGO的给药体系，有利于CD22过表达的肿瘤细胞吸收DOX，从而提高抗肿瘤效果。

PEG修饰的氧化石墨烯片负载喜树碱衍牛物SN-38

　　纳米石墨烯除可用于载药之外，还可用于基因转染。Dai课题组将聚乙烯亚胺(PEI)阳离子非共价结合到带负电荷的GO表面，形成PEI-GO复合物，这种带正电的PEI-GO复合物可以进一步地结合质粒DNA(pDNA)转染到HeLa细胞内。

　　总之，基于GO的结构特点经过化学处理和修饰之后可用来负载和递送多种分子包括化学药物、基因、光敏剂等，为癌症和其它疾病的治疗提供了新的方法和手段，这种药物载体载药量高，并能够靶向输送和缓释，但是相关的研究工作都还不成熟，相信不久的将来基于石墨烯的药物载体可以实现临床应用。

　　石墨烯在抗菌和抗病毒方面的应用

　　Akhavan等研究发现氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO)对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureu.s)均有较好的抗菌效果，并且通过对比发现，rGO的抗菌效果更佳，革兰氏阳性菌与GO和rGO接触后，会导致其细胞膜的破坏，革兰氏阴性菌膜外有一层细胞壁保护，不容易受到破坏。Chen等评价了不类型的石墨烯材料的抗菌效果，包括石墨、氧化石墨、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯，结果同样是rGO的抗菌效果最好，其次是GO，它们能导致细胞膜的破坏和氧化应激的产生。

　　因为GO与细菌接触时，更容易发生电荷转移，所以抗菌效果更好，用作抗病毒材料对环境无污染。因此，石墨烯的衍生物有望用作抗病毒材料和用作制备病毒检测装置。

　　石墨烯在细胞和肿瘤成像中的应用

　　年，Dai课题组除了发现氧化石墨烯纳米片(NGO)可以作为药物载体之外，还研究了NGO在活细胞成像方面的应用，制备了不同尺寸性能特异的PEG-NGO片，在缓冲溶液和血清中具有很好的稳定性，不易团聚，并且在可见光到红外光区可以受激发而发射荧光，使得PEG-NGO片可用于活细胞的近红外区(NIR)成像。而近年来，研究者们开始研究尺寸更小的GO(小于l0nm)，被称作石墨烯量子点(GQDs)。Pan等通过简单的水热法切割石墨烯片得到发蓝光的GQDs。但是其荧光强度远小于常规的有机染料。Eda等将化学法得到GQDs暴漏到阱蒸汽中还原，明显提高了荧光强度。利用烷基胺对GQns进行表面功能化修饰也能明显提高其荧光强度。

　　纳米石墨烯不仅可用作细胞成像，还可以用作肿瘤靶向成像。Hong等研究了纳米石墨烯用作体内肿瘤靶向，并利用正电子发射计算机断层显像(PET)定量评估了药代动力学和肿瘤的靶向效果。将TRC（一种单克隆抗体能够特异性的绑定到CD上，CD是肿瘤血管生成的一种血管标记物）结合到NGO上，形成靶向荧光探针，这种探针可以特异性地探测到体内肿瘤血管，通过靶向肿瘤血管上的CD，从而精确定位肿瘤的位置和大小。

　　总结

　　短短几年石墨烯及其衍生物在医用各领域的研究已经取得一定的进展，但大多数都处于初步阶段，以体外细胞实验居多，体内实验很少，要实际应用到临床还有很多实验数据要补充。现在急需解决的一种重要问题就是彻底地系统地研究石墨烯与细胞、组织和器官的相互作用，特别是细胞的摄取机制，只有彻底理解这方面的内容，才能够促进基于石墨烯和氧化石墨烯的纳米医学平台的发展。

　　以石墨烯为平台的生物传感方面和疾病诊断方面，虽然灵敏度达到了实际要求，但是其可靠性、重现性和稳定性还需要进一步的实验研究，才能制备出相应的器件设备，实现其实际应用。功能化的氧化石墨烯作为高效载药的平台，特别是难溶的抗癌药物，已经得到了广泛的研究，氧化石墨烯作为载体，不应该只局限在抗癌药物和基因，还应该扩展到蛋白、生长因子以及其它的生物分子和药物，并能够同时运载几种药物或者分子，以便应用于更有效的疾病治疗。石墨烯还是要找到属于自己独一无二的高端应用才行！

来源：DT高分子在线

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