具有BCORCCNB3融合基因的尤文样

来源：中华病理学杂志

作者：王晓娟，李文才（医院病理科）赵丹珲，王映梅，刘一雄，李侠，李明阳，李文才，王哲（西安，第四军医大学医院病理科）

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许多发生于软组织和骨的小圆细胞恶性肿瘤，其组织形态很相近，有时凭借免疫组织化学和分子诊断也无法明确分类，经常给病理学家和临床医师的诊断和治疗造成困难。在这组肿瘤中，最常见的是尤文肉瘤。尤文肉瘤具有ETS家族基因的断裂，最常见累及的是Fli1和ERG基因，也包括ETV1、ETV4等基因。EWSR1和FUS基因是尤文肉瘤最常受累的伴侣基因。但是仍有部分小圆细胞肉瘤并不具备尤文肉瘤典型的遗传学和表型特征，被称为"尤文样肉瘤"。新近，在尤文样肉瘤中发现了一些肿瘤具有特殊遗传改变，如CIC-DUX4融合基因、BCOR-CCNB3融合基因、BCOR-MAML3融合基因等，分别成为独立的肿瘤类型。

　　具有BCOR-CCNB3融合基因的未分化肉瘤(BCOR-CCNB3肉瘤)是近几年来发现的一种发生于骨与软组织的、组织学形态类似于Ewing/PNET肉瘤的小圆细胞恶性肿瘤[1]，研究发现与经典Ewing/PNET具有EWS-ETS染色体异位不同，该肿瘤存在因X-染色体臂内倒位而产生的BCOR-CCNB3基因融合，即bcl-6共抑制因子(bcl-6co-repressor,BCOR)和睾丸特异性细胞周期素B3(cyclinB3，CCNB3)在X染色体上发生融合[2]。尽管BCOR-CCNB3肉瘤在新近WHO分类中被列于Ewing/PNET肉瘤分类下，但由于其存在与经典Ewing/PNET肉瘤不同的基因表达谱，所以BCOR-CCNB3肉瘤应被视为一个独立的组织学类型[3]。Pierron等[1]最早对BCOR-CCNB3肉瘤的遗传学和临床病理特点进行系统的研究报道。此后，又陆续有少量病例报道[4,5]。我们将描述BCOR-CCNB3肉瘤的镜下特点，探讨其免疫表型及鉴别诊断。

1．临床资料：

　　收集医院病理科年1月至年12月间病理诊断为Ewing/PNET肉瘤或尤文样肉瘤例患者资料，由2位经验丰富的病理医师参照文献标准[1,4]，结合患者临床资料及肿瘤的组织学形态、免疫组织化学和分子检测结果，排除典型的Ewing/PNET肉瘤，筛选不典型尤文样肉瘤病例进行后续研究，主要指标筛选包括：(1)肿瘤细胞形态偏向梭形或卵圆形，染色质较淡染。(2)免疫组织化学结果显示CD99并非细胞膜强阳性。(3)荧光原位杂交(FISH)未检测到EWSR1基因断裂。另选择12例形态典型并经免疫组织化学和FISH检测证实为尤文肉瘤的病例作为对照。

　　2．逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：

　　对3.7%甲醛固定、石蜡包埋组织进行RT-PCR法检测BCOR-CCNB3基因融合。总RNA提取及反转录采用RecoverAllTM总核酸提取试剂盒(LifeTechnologies公司)及PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit(Takara公司)，GAPDH作为内参照，引物序列为：上游引物：5′-GGAGTCAACGGA-TTTGGT-3′，下游引物：3′-GTGATGGGATTTCCA-TTGAT-5′，扩增片段长度为bp。BCOR-CCNB3引物序列为：上游引物：5′-AATTCACGAACGAAAT-TCAGACTCT-3′，下游引物：3′-GGGTGTTTTG-GAGGTGGTGGAT-5′，扩增片段长度为bp。PCR扩增产物均经直接测序对比(华大基因公司)。

1．临床资料：

　　在例Ewing/PNET肉瘤及尤文样肉瘤病例中，筛选出不典型尤文样肉瘤17例，通过CCNB3免疫组织化学、RT-PCR检测及测序后共筛选出3例BCOR-CCNB3肉瘤，其中女性1例，男性2例；发病年龄8～11岁，病变位于骨(2例)及软组织(1例)。

　　2．病理检查：

　　(1)BCOR-CCNB3肉瘤的组织学特点：肿瘤细胞可呈圆形、短梭形，局部呈旋涡状排列；卵圆形、短梭形细胞呈实性片状排列；肿瘤组织中可见纤细的毛细血管结构；可见出血、坏死；局部间质纤维化(图1)。(2)Ewing/PNET肉瘤的组织学特点：小圆细胞密集排列、呈片状排列；细胞圆形或卵圆形；核型较规则，核膜清晰，核染色质细致、均匀，可有小核仁；常可见菊形团结构。

图1经典Ewing肉瘤及BCOR-CCNB3肉瘤的影像及组织学特征；图1A例2，CT显示腰5椎体左侧及左侧附件骨质破坏伴软组织影；图1B经典Ewing/PNET肉瘤小圆细胞密集排列成小叶状或片状HE高倍放大；图1CBCOR-CCNB3肉瘤(例3)肿瘤细胞可呈圆形、短梭形HE高倍放大；图1D例1，胞质淡染的短梭形肿瘤细胞排列松散或紧密，核染色质细、核仁不明显，其间可见纤细的毛细血管分隔HE高倍放大；

　　图2经典Ewing肉瘤及BCOR-CCNB3肉瘤的免疫组织化学检测；图2A经典Ewing/PNET肉瘤，CD99胞膜弥漫强阳性表达Ventana自动免疫组织化学仪高倍放大；图2BBCOR-CCNB3肉瘤，CD99(例3)呈胞质或核旁点状阳性表达Ventana自动免疫组织化学仪高倍放大；图2CCCNB3弥漫的胞核阳性表达SP法高倍放大；图2DTLE1弥漫的核阳性表达SP法中倍放大；图2EcyclinD1核弥漫阳性表达Ventana自动免疫组织化学仪高倍放大。

　　3．免疫组织化学及RT-PCR检测：

　　17例尤文样肉瘤中有3例免疫组织化学检测都呈CCNB3、cyclinD1和TLE1阳性表达(图2)。CCNB3阳性病例的CD99未呈现经典的胞膜强阳性，而出现胞质或核旁阳性。3例均通过RT-PCR检测到BCOR-CCNB3融合基因的表达(图3A)；另有1例尤文样肉瘤为CCNB3胞质阳性着色，但RT-PCR未检测到BCOR-CCNB3基因融合(图3)。其他相关免疫表型的表达情况见表1。

表1：3例BCOR-CCNB3肉瘤的临床病理特点。

图3BCOR-CCNB3融合检测；图3A　示逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BCOR-CCNB3融合基因电泳结果，1～3分别为例1、例2、例3融合基因检测结果，4为CCNB3胞质阳性表达的尤文样肉瘤，5～8为GAPDH；图3B　示RT-PCR检测3例BCOR-CCNB3肉瘤产物测序比对结果。

　　4．测序结果：

　　3例BCOR-CCNB3肉瘤的RT-PCR基因融合检测结果与直接测序结果一致(图3B)，BCOR、CCNB3基因出现融合。12例经典尤文肉瘤免疫组织化学染色CCNB3均为阴性(0/12)，个别病例TLE1呈弱阳性表达(1/12)，部分病例cyclinD1呈灶状阳性(4/12)。

　　5．随访：

　　3例BCOR-CCNB3肉瘤随访时间为12～56个月，2例未进行常规手术切除及化疗，放弃治疗，患者均在1年内死亡；1例手术后常规化疗(异环磷酰胺方案、长春新碱-洛铂-多柔比星方案、长春新碱-培美曲塞-顺铂方案)并辅以术区辅助性放疗，56个月后仍存活，有复发但无远处转移，患者一般状况尚可。

好发于儿童的小圆细胞肿瘤包括横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、Ewing/PNET肉瘤、促纤维组织增生性小圆细胞肿瘤、淋巴瘤等，通过免疫组织化学、分子遗传学等检查后90%以上可被确诊，但仍有近10%的分化差或未分化小圆细胞肿瘤，通过详尽的组织学观察、应用免疫组织化学和分子遗传学等辅助检查后仍难以明确归类。其中Ewing/PNET肉瘤是儿科病理常见的小圆细胞肿瘤，其恶性程度高、预后差。Ewing/PNET肉瘤的组织学特点主要为小圆形细胞密集排列成小叶状或片状，核型较规则，圆形或卵圆形，核膜清晰，核染色质细致、均匀，核仁不明显或见小核仁，常可见菊形团结构。免疫组织化学表达CD99和波形蛋白，不同程度表达神经元特异性烯醇化酶、Fli1、SYP和Leu7等[6]。CD99是诊断Ewing/PNET的非常敏感的标志物，呈弥漫的细胞膜强阳性表达。但其特异性不高，除Ewing/PNET肉瘤以外，在腺泡状横纹肌肉瘤、粒细胞肉瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、肾母细胞瘤等也可表达[5]。明确Ewing/PNET肉瘤的诊断，还需要进行EWS-Fli1等特异性易位融合基因表达的检测。EWSR1-Flil融合基因是Ewing/PNET肉瘤最常见的遗传学改变[7]；除了11q12上的Fli1基因，EWSR1的其他伙伴基因还包括ERG、FEV、ETV1、ElA-F、SP3等ETS家族的基因[8,9,10,11,12]。

　　一些组织学与Ewing/PNET肉瘤相似但具有ETS家族基因以外的染色体易位等分子改变的小圆细胞肿瘤被称为尤文样肉瘤。近几年来，通过高通量测序技术从尤文样肉瘤中鉴定出一些新的独立类型的肉瘤，具有一些特征性的融合基因，如BCOR-CCNB3肉瘤、CIC-DUX4肉瘤及BCOR-MAML3/ZC3H7B肉瘤等[13,14]。BCOR-CCNB3肉瘤在X染色体出现臂内倒位导致了BCOR末端编码序列与CCNB3的5′外显子剪接体位点发生融合，形成BCOR-CCNB3融合基因。这个融合基因包括BCOR的全长和CCNB3的C末端[2]。体外研究已证实BCOR-CCNB3融合蛋白有成瘤性，能促进肿瘤的增殖[1]。关于BCOR-CCNB3肉瘤病例的报道较少。多数患者发病年龄轻，为儿童或青少年，成年人少见，男性多见[1,5,6,15]，可能与2个致病基因均位于X染色体而在男性易造成显性表型相关。目前这种关于男性对X染色体臂内易位易感性明显增加的确切机制尚不明确。

　　BCOR-CCNB3肉瘤的组织学特点：肿瘤细胞可呈圆形、短梭形，局部呈旋涡状、实性片状排列，可见出血、坏死，局部间质纤维化。有些病例可呈血管周细胞瘤样的改变[4]。虽然BCOR-CCNB3肉瘤多由小圆细胞构成，但与Ewing/PNET肉瘤相比，其细胞核大小和形态具有更大的异质性，缺乏Ewing/PNET肉瘤那样单一的组织形态，肿瘤细胞常呈短梭形、伴有黏液样的间质，可观察到类似于经典型肾透明细胞肉瘤样的组织学形态：胞质淡染的短梭形肿瘤细胞排列松散或紧密，核染色质细、核仁不明显，其间可见纤细的毛细血管分隔。值得注意的是，大多数BCOR-CCNB3肉瘤中CD99染色胞膜着色较弱，可呈胞质或核旁点状阳性表达，或偶尔完全阴性，而CCNB3呈弥漫的细胞核阳性表达；Ewing/PNET肉瘤CD99多呈弥漫的胞膜强阳性表达，CCNB3均呈阴性。BCOR-CCNB3肉瘤其他免疫表型显示出非特异性：cyclinD1、TLE1可呈弥漫阳性表达，CD56、bcl-2、CD、波形蛋白可有不同程度的表达，本组1例甚至出现Fli1弱阳性表达。肿瘤细胞Ki-67阳性指数较高可达70%。本组12例经典尤文肉瘤对照病例免疫组织化学染色CCNB3均为阴性(0/12)，个别病例TLE1弱阳性(1/12)，部分病例cyclinD1呈灶阳性(4/12)。CCNB3在一些腺泡状横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤中可呈弱到中等强度的胞质阳性表达[16]。我们的结果显示，CCNB3、TLE1、cyclinD1在尤文肉瘤中少见阳性，因此CCNB3、cyclinD1及TLE1阳性有助于鉴别尤文肉瘤和BCOR-CCNB3肉瘤。另有新近研究表明，BCOR免疫组织化学检测在BCOR-CCNB3肉瘤、BCOR短串联重复序列肉瘤、YWHAE-NUTM2肉瘤和BCOR-MAML3/ZC3H7B肉瘤中具有较好的敏感性[17]。在这些未分化肉瘤中，BCOR呈现弥漫的核强阳性表达，而且均检测到BCORmRNA高表达，因此，BCOR和CCNB3可作为筛选该类肿瘤的标志物。确诊则需要RT-PCR检测证实融合基因的转录本。由于BCOR和CCNB3这2个基因都位于X染色体上，而且位置较近，利用FISH方法则不易判读其断裂情况。本组发现1例44岁女性发生于小腿软组织的尤文样肉瘤CCNB3呈弱到中等强度的胞质阳性表达，但是没有检测到BCOR-CCNB3融合基因，因此CCNB3胞质阳性并不具有诊断价值。

　　源于骨的BCOR-CCNB3肉瘤较为多见[1,4,15]。本组2例BCOR-CCNB3肉瘤影像学显示发生于骨，都伴有骨质破坏。鉴于可能会出现针对融合基因及其下游途径的新治疗方法，正确识别Ewing/PNET肉瘤和尤文样肉瘤中的基因融合非常重要[18]。由于报道较少，对于BCOR-CCNB3肉瘤治疗效果的回顾性分析还不多。发生在骨盆的BCOR-CCNB3肉瘤比四肢或躯干的生存期要短[19]，但生存率要高于经典Ewing/PNET肉瘤。伴有转移的病例往往预后不良。化疗对于肿瘤的控制、改善患者的总生存期及无瘤间期都很重要[15]。

　　新近报道的少数软组织小圆细胞肿瘤需要与BCOR-CCNB3肉瘤鉴别：(1)存在BCOR与MAML3或ZC3H7B基因融合的肉瘤，这种BCOR-MAML3/ZC3H7B肉瘤也常见于年轻人，在组织形态上与低分化小细胞滑膜肉瘤有一定的重叠，常表现为卵圆形和梭形细胞混合呈片状排列，CD99呈强的膜阳性表达，WT1往往为阴性，发生融合的基因分别位于不同的染色体上，通过FISH和RT-PCR方法可以证实[20]。而低分化小细胞滑膜肉瘤多呈TLE1阳性并伴有SYT/SSX融合。(2)越来越多伴有CIC-DUX4融合基因的软组织肉瘤被报道[21,22]。有人推测经典Ewing/PNET肉瘤和CIC-DUX4肉瘤可能存在密切关联[6]。CIC-DUX4肉瘤和BCOR-CCNB3肉瘤在形态学上有一定重叠，肿瘤细胞都可呈短梭形，伴有黏液样基质，但CIC-DUX4肉瘤往往有突出的核仁[23]。约70%的CIC-DUX4肉瘤有细胞核WT1表达[24]，是提示该类型肿瘤诊断的重要线索。与BCOR-CCNB3肉瘤比较，CIC-DUX4肉瘤患者的发病年龄范围更广，发病部位主要为软组织，并缺乏明显的男性易感性。CIC-DUX4肉瘤的侵袭性较强，患者多在诊断后16个月内死亡[1,21]。在本组病例和文献中报道的BCOR-CCNB3肉瘤形态改变中，其中一部分病例与肾脏透明细胞肉瘤形态相似，其特点包括密集排列的短梭形肿瘤细胞，染色质细，纤细的毛细血管网等，都提示2种肿瘤可能相关。我们的研究中发现cyclinD1在BCOR-CCNB3肉瘤和肾脏透明细胞肉瘤中都呈弥漫的细胞核强阳性[25]。新近报道约80%的肾透明细胞肉瘤中BCOR基因末端存在短串联重复序列[26,27,28]，并且RNA转录组测序发现，肾脏透明细胞肉瘤与软组织BCOR-CCNB3肉瘤的基因表达谱很接近[28]。BCOR-CCNB3肉瘤和肾脏透明细胞肉瘤还具有相似的好发年龄和性别，两者遗传改变都累及了位于X染色体的BCOR基因并导致BCOR基因激活[28]。基于以上相似之处，我们认为二者是具有重叠特征的肿瘤谱系。更有趣的是，新近研究发现一部分软组织小圆细胞未分化肉瘤中存在BCOR基因的短串联重复序列[29]，与BCOR-MAML3肉瘤、肾脏透明细胞肉瘤及BCOR-CCNB3肉瘤相似，都存在BCORmRNA表达上调，同时在形态谱上也有重叠。与BCOR-CCNB3肉瘤和肾脏透明细胞肉瘤在形态学和遗传特征上存在重叠的婴儿原始黏液样间叶性肿瘤以原始的梭形、多角形和圆形细胞组成，伴富含纤细血管网的黏液样间质，瘤细胞CD99、波形蛋白、CD阳性，大多数伴有BCOR短串联重复序列。与尤文肉瘤和CIC-DUX4肉瘤相比较，BCOR短串联重复序列软组织肉瘤、BCOR-MAML3肉瘤、肾脏透明细胞肉瘤及BCOR-CCNB3肉瘤在形态上更多地表现为肿瘤细胞呈卵圆、梭形，伴有间质的黏液变性。BCORmRNA过表达的遗传学机制包括基因融合及短串联重复序列，推测其可能是与小圆细胞未分化肉瘤发生有关的重要分子事件。

　　遇到形态不典型、不具有经典遗传学改变，发生于骨或软组织的小圆细胞肿瘤时，如果免疫标志物WT1阳性，CD99为不典型膜阳性时应考虑除外CIC-DUX4肉瘤。WT1阴性时，在除外差分化滑膜肉瘤(TLE1阳性、CCNB3阴性)的同时，还应考虑到BCOR-CCNB3肉瘤(TLE1、CCNB3阳性)和BCOR-MAML3/ZC3H7B肉瘤(CD99膜阳性)的鉴别诊断，明确诊断要依靠分子遗传学检测。

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