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南方医科大学白晓春与蔡道章报道M1型极化

2021-7-10 来源：本站原创浏览次数：次

作者：陈君鑫/秦安

来源：科研小助手

编者按：

南方医科大学白晓春与蔡道章教授研究团队在骨关节炎研究领域取得重要进展，研究成果分别以“TyrosineKinaseFynPromotesOsteoarthritisbyActivatingtheβ-cateninPathway（酪氨酸激酶Fyn通过激活b-catenin通路促进骨关节炎发展）”和“SynovialMacrophageM1PolarizationExacerbatesExperimentalOsteoarthritisPartiallythroughR-spondin-2（M1型极化的滑膜巨噬细胞通过分泌R-spondin-2促进骨关节炎进展）”为题，于年3月19日和7月11日在AnnalsoftheRheumaticDiseases（《风湿病年鉴》）上在线发表。

白晓春教授团队与蔡道章教授团队合作研究发现，M1型极化的巨噬细胞聚集在OA病人与OA模型小鼠滑膜组织中，进而在巨噬细胞特异mTORC1信号通路活化的基因敲除小鼠中发现，巨噬细胞向M1极化并促进滑膜增生与OA进展；使用雷帕霉素抑制mTORC1或特异敲除巨噬细胞中的mTORC1可使其向M2极化，抑制滑膜炎症并延缓小鼠OA进展（图2）。这些研究直接证明巨噬细胞M1型极化促进滑膜增生、滑膜炎症与OA进展，控制滑膜巨噬细胞向M2极化可能是防治OA的新策略。

今天科研小助手就对最新的这篇文章进行解读。

背景:骨关节炎：是退行性关节疾病，软骨磨损、软骨下骨硬化经典表现。根据目前研究，骨关节炎主要表现为关节软骨的进行性退变（透明软骨减少，钙化软骨增多），关节间隙变窄，软骨下骨重塑，骨赘形成，滑膜炎等。现在越来越多的证据表明，滑膜炎与OA的进展有关系。

滑膜：滑膜有两层结构，分为内表层和下层，内表层由2~3层巨噬细胞和纤维样滑膜细胞组成，其中滑膜细胞能分泌滑膜液，巨噬细胞能吞噬磨损的碎片。下层由纤维结缔组织、血管、少量淋巴细胞和巨噬细胞组成。滑膜的两层结构被增生的巨噬细胞浸润是滑膜炎的主要表现。

巨噬细胞：巨噬细胞在不同的微环境下有不同的表达谱，即M1和M2两种功能极化状态。简单来说，M1主要负责抵御病原体（促进炎症反应的发生），能分泌IL-1β，TNF-α，IL-6等关键细胞因子，而M2主要负责组织修复。已经有文献报道在OA发生过程中，滑膜会发生巨噬细胞的聚集。然而，在针对性使巨噬细胞凋亡的肥胖转基因小鼠中，去除巨噬细胞（使M1、M2巨噬细胞均大量减少）不能减轻肥胖小鼠的OA严重程度，这就引起了文章作者的兴趣，巨噬细胞极化是否与OA发生过程有关。

文献报道mTORC1通路与巨噬细胞极化过程中起着关键的调控作用，目前mTORC1机制可由简图概括。在炎症反应中，TSC1和TSC2复合体具有GTP磷酸酶的作用，能使p-Rheb去磷酸化，抑制mTORC1激活。文献报道影响TSC1敲除可以明显减少IL-4诱导的巨噬细胞M2极化，并增强LPS引起的炎症反应，而mTORC1敲除则会明显减少M1极化。那么mTORC1在OA中是否通过巨噬细胞极化来影响疾病？

正文解读

作者采用髓系细胞TSC1敲除和rheb1敲除小鼠（只对中性粒细胞和巨噬细胞进行敲除），采用的模型是胶原酶诱导的骨关节炎模型（滑膜反应最明显）和内侧半月板手术模型（滑膜反应最弱）。作者首先使用HE染色对正常和OA进行了表型鉴定，control组滑膜内表层仅有2~3层细胞，下层纤维结缔组织结构正常，未见明显细胞浸润。OA组细胞可见大量细胞浸润，符合滑膜炎改变。

作者通过免疫荧光和组化来对细胞进行鉴定，F4/80为巨噬细胞marker,iNOS为M1型巨噬细胞marker，CD为M2型巨噬细胞marker。可以发现相较于control组，OA组F4/80、iNOS荧光强度明显增强，而CD未见明显上调。可见在OA发生过程中，巨噬细胞聚集，且以M1巨噬细胞为主。

接着作者对胶原酶诱导的骨关节炎小鼠模型（CIOA）进行了表型鉴定，control组关节软骨结构正常，滑膜未见明显增生。而CIOA模型小鼠在7天和28天均可见滑膜炎样改变，内表层可见明显细胞浸润，另外关节软骨结构异常，透明软骨范围减小，钙化软骨范围增大。

接着作者通过免疫荧光和组化对巨噬细胞进行了鉴定，发现在7天以及28天CIOA小鼠模型中巨噬细胞明显增多，M1型巨噬细胞明显增多，M2型巨噬细胞在7天CIOA模型中在内表层和下层均可见增多，然而在28天CIOA模型中仅少量在下层可见。

综合Figure1，在OA发生阶段，巨噬细胞会聚集在滑膜，尤以M1极化巨噬细胞为明显，M2细胞在前期聚集明显，后期下降，说明两者可能在OA的发生过程中有一定的作用。已经有文献报道，特定激活小鼠髓系细胞mTORC1蛋白活性，能增强巨噬细胞M1极化，以及能引起自发M1-相关炎症反应，那mTORC1与OA中巨噬细胞极化以及对OA进展有无影响目前仍然未知。S6蛋白是mTORC1的下游效应分子，作者发现在人OA的滑膜中磷酸化p-S6蛋白明显增多，而且，p-S6和F4/80有一定程度上的共定位，而同时S6水平未见明显改变，这就排除了S6蛋白增高引起的p-S6磷酸化增加，因此后面作者直接用p-S6水平来表示mTORC1活性。

在control组中，未见明显p-S6表达，而在CIOA7天和28天小鼠模型中可见明显的p-S6表达以及F4/80表达，两者无明显差异，提示在CIOA模型中随着OA的发生，mTORC1活化。

为了证明mTORC1活化对OA中巨噬细胞的极化有影响，作者使用了特定髓系细胞TSC1敲除的小鼠（能促进mTORC1活化）。通过免疫荧光，作者发现TSC1KO小鼠p-S6水平明显升高，证实mTORC1活性增强。iNOS表达增高，累计下层，提示M1型巨噬细胞聚集增加，滑膜炎明显。而免疫组化发现CD明显下调，提示M2型巨噬细胞减少。这就证实mTORC1活化在OA发展中同样起着调节巨噬细胞极化的作用。

通过前面的实验我们已经知道，OA发生过程中滑膜存在巨噬细胞聚集，且以M1型巨噬细胞为主，mTORC1在巨噬细胞极化中起着重要作用。那么M1巨噬细胞增多对OA有什么作用呢？本文作者直接鉴定TSC1KO小鼠表型来代表M1巨噬细胞极化在OA中的表型。（如果TSC1KO有多条途径来影响OA进展，个人认为这种做法有点不科学）。作者对control和TSC1KO小鼠模型进行了CIOA造模，分别取4周和8周膝关节标本进行番红/固绿染色。4周时，TSC1KO小鼠可见明显骨赘形成，关节软骨欠光整，而且透明软骨厚度相对control明显减小，关节间隙明显狭窄。在8周时，TSC1KO小鼠骨赘较control组比4周时更加明显，关节软骨破坏明显，透明软骨近乎消失，关节间隙由于透明软骨的消失重新增大。说明，mTORC1活化导致的巨噬细胞M1极化将加速CIOA小鼠模型OA进展。

对control和TSC1KO8周CIOA小鼠模型标本进行免疫组化发现TSC1KO小鼠标本较control组MMP13表达明显升高。

Micro-CT扫描发现TSC1KO小鼠骨赘体积较control组更加明显。

综上所述，mTORC1活化导致的巨噬细胞M1极化将加速OA进展。既然M1能加速OA进展，那么M2巨噬细胞聚集是否会抑制OA进展呢？作者构建了特定髓系细胞Rheb1KO的小鼠模型（抑制mTORC1活化，已有文献报道这种小鼠将减少巨噬细胞M1极化，而促进M2极化）。作者对Control和髓系细胞Rheb1KO小鼠进行了CIOA造模，4周后取模型进行表型鉴定。Rheb1KO小鼠p-S6水平相对control下调，证实mTORC1活化减少。iNOS内表层荧光范围减小，提示M1巨噬细胞极化减少，而免疫组化CD阳性细胞比例明显升高，提示巨噬细胞M2细胞极化增强。综上所述，mTORC1活化抑制在OA中将促进巨噬细胞M2极化。

那么巨噬细胞M2活化对OA的发展有什么功能呢。作者取4周和8周的control和Rheb1KO的造模小鼠标本进行番红固绿染色，可以发现4周、8周时rheb1KO小鼠透明软骨厚度较control组大，并且control组滑膜相较rheb1KO组肥厚。在8周时control组出现了骨赘，而rheb1KO小鼠未见。Control和rheb1KO两组小鼠模型4周时OA评分无统计学意义，8周时OA有显著差异。

作者取了8周的关节软骨进行免疫组化检测MMP13，发现rheb1KO小鼠mmp13表达明显下降。

由此可见，Rheb1KO，mTORC1活化抑制，M2巨噬细胞极化将延缓CIOA小鼠模型OA的进展。前面已经验证了极化的巨噬细胞在OA起作用，接下作者将探究极化的巨噬细胞具体将如何对OA起作用。

作者取control小鼠和TSC1KO小鼠的巨噬细胞样本进行了RNA测序，发现IL-1,TNF-α，IL-6表达升高，这3种因子能促成OA的发生，而M1能分泌这3种细胞因子。作者用QPCR和ELISA证实了测序结果。总之，M1极化细胞能通过分泌细胞因子来促进OA进展。

我们都知道软骨成骨分化是OA进展中的一个重要环节，作者接下来便开始研究巨噬细胞极化对软骨分化的影响。作者取了control和TSC1KO敲除小鼠的巨噬细胞进行培养，之后分别取两组上清培养液用于培养ATDC5软骨祖细胞，并加入胰岛素、转铁蛋白、硒（三者简称ITS）等诱导软骨分化，发现相较于control，TSC1KO组sox9、col2a1、Acan表达明显下降，而Runx2和col10a1表达明显升高，提示巨噬细胞能促进软骨肥大、成熟和矿化。

接下来作者又对上述培养的ATDC5细胞进行的甲苯胺蓝染色，发现加入了TSC1KO组条件培养基的ATDC5细胞矿化明显增加。

综合上述研究，我们可以发现，通过活化mTORC1活化促成的M1巨噬细胞能通过分泌细胞因子来促进软骨细胞成熟和矿化，同时也提示其在OA的软骨变性中起着重要作用。除去经典的细胞因子IL-1、TNF-α等，作者还发现基因芯片数据中细胞因子Rspo2在TSC1KO巨噬细胞中表达是control组的33.6倍，并通过QPCR和Elisa证实。

Rspo2已经被证明与wnt有协同作用，能促进beta-catenin活化，促进软骨和成骨细胞分化。

首先作者首先通过对4周CIOA小鼠标本进行免疫组化实验，证明Rspo2在滑膜中的表达，并发现TSC1KO小鼠滑膜中Rspo2表达明显上调，同时还检测了4Wcontrol和TSC1KO小鼠血清中Rspo2的表达，发现血清Rspo2水平显著升高。

随后作者又通过免疫组化发现了Rspo2受体Lrg5在关节软骨中高表达，在4周TSC1KO小鼠模型关节软骨中Lrg5表达稍高于control组，但是没有统计学意义。尽管如此，作者已证明TSC1KO敲除小鼠M1巨噬细胞能分泌更多的Rspo2，同样提示Rspo2协同wnt通路来影响OA进展的可能性。作者通过对wnt经典分子beta-catenin进行荧光检测，发现在TSC1KO小鼠模型中beta-catenin表达明显升高，证明在TSC1KO组wnt通路的活化。

接下来作者通过挽救实验证明Rspo2在CIOA小鼠模型中的作用。通过TSC1KO小鼠以及在TSC1KO小鼠关节腔中注射Rspo2抗体中和Rspo2的方法，作者构建了8周的KO和挽救模型，发现8周TSC1KO小鼠关节软骨磨损明显，骨赘体积更大，OA评分更高，而挽救组关节软骨相对完整，骨赘体积也较小，这就说明Rspo2作为M1巨噬细胞的分泌因子，能促进OA进展，阻断Rspo2只能部分缓解OA进展。

随后作者又在普通小鼠上构建了CIOA和CIOA+rhRhpo2（关节腔注射）的小鼠模型，发现关节腔注射rhpo2的小鼠模型在8周时，关节软骨退变明显，OA评分显著升高，micro-ct提示骨赘体积也更大，这也进一步论证Rspo2有加速OA进展的作用。

那么Rspo2是如何加速OA进展的呢？Rspo2已经被报道与wnt有协同作用，作者随后通过免疫荧光检测了beta-catenin在control、TSC1KO组、挽救以及协同组的关节软骨中的表达情况，发现TSC1KO、关节腔注射Rspo2能提高beta-catenin表达，而在TSC1KO组中中和Rspo2能减弱beta-catenin表达。这就证明，M1巨噬细胞极化促进OA进展，有部分作用是通过Rspo2来完成的。

总结来说，作者通过免疫荧光、免疫组化、QPCR、以及micro-ct、Elisa、番红固绿等实验技术证明，在OA进展中会出现mTORC1活化，使得M1巨噬细胞极化增强，而M2巨噬细胞极化减少的情况。M1巨噬细胞会加速OA进展，而M2巨噬细胞能抑制OA进展。M1巨噬细胞通过分泌IL-1,IL-6，TNF-α来起作用，或通过分泌Rspo2来活化wnt通路来引起OA。

参考文献：

Zhang,H.,etal.SynovialmacrophageM1polarisationexacerbatesexperimentalosteoarthritispartiallythroughR-spondin-2.AnnRheumDis77,-().