NEJM综述尤因肉瘤发病机制及治疗方法

詹姆斯·尤因（JamesEwing）

年，在纽约病理学会（NewYorkPathologicalSociety）的一次会议上，詹姆斯·尤因（JamesEwing）将一名14岁女童身上的罕见肿瘤描述为“弥漫性骨内皮瘤”。该肿瘤最初被诊断为骨肉瘤，但其结构、细胞形态学特征及对放疗的高度敏感性使尤因认为这是一种独立疾病，甚至推测其起源于内皮细胞。他后来还报告了其他青少年发生的类似肿瘤，病理科医师根据这些肿瘤共同的形态学和免疫组化特征，将其称为尤因肉瘤、Askin瘤和外周原始神经外胚层肿瘤。在确诊尤因肉瘤道路上，第一个里程碑式发现出现在70多年后，当时发现了可定义尤因肉瘤的最常见染色体易位。在尤因做出上述开创性观察一个世纪后，以其名字命名的恶性肿瘤成为一次基因重排后即发展成实体瘤的范例。在这篇综述中，讨论了尤因肉瘤的临床特征和发病机制，以及现有和实验性治疗方法。就机制角度而言，总结了独特染色体易位利用允许细胞（permissivecell）的表观遗传机制来改变其转录组，并产生甚至可逃避最高强度常规治疗的异质性癌症的机制。发病率和临床特征尤因肉瘤是骨骼和软组织的侵袭性恶性肿瘤，主要发生于儿童和年轻成人，发病率为1/万，其中欧洲裔的发病率高达非洲裔的近10倍，男性比女性略微高发（男性与女性患者的比值，1.6∶1.0），并且15岁人群的发病率最高。尤因肉瘤约占儿童恶性肿瘤的2%，是儿童第二高发的骨恶性肿瘤，可发生于身体任何部位，但最常见的发病部位是骨盆和长骨近端。约20%患者的肿瘤位于骨外，可发生于多个器官（图1）；骨外尤因肉瘤在成人中的发病率远高于在儿童中的发病率。如果在成人软组织中观察到未分化的圆形细胞肿瘤，则鉴别诊断中应包括尤因肉瘤。图1.尤因肉瘤的临床特征影像学检查一般具有较强的提示性，典型的多发性、融合性、溶骨性病变可在标准胶片产生“虫蚀样”图像。肿瘤的骨膜下生长可形成另外两种典型图像，即科德曼三角和“洋葱皮样”外观，分别代表移位骨膜和由此导致的增殖反应（图1）。一般通过计算机断层扫描或磁共振成像监测肿瘤转移情况和对治疗的应答。尤因肉瘤的诊断依赖于对活检标本或手术切除的肿瘤组织进行组织学和分子分析。组织学检查中一般可见大细胞核，少细胞质的层状蓝色小圆细胞（图1）。这些特征表示分化能力低，数种恶性肿瘤均具有这一特征，如神经母细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤（DSRCT）、腺泡状横纹肌肉瘤、外周神经外胚层肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、低分化滑膜肉瘤，以及罕见的具有独特基因特征的“尤因样”肿瘤。免疫组化分析结果不具有特异性，包括CD99（也称为MIC2）在膜上强表达，以及CD56和突触小泡蛋白的频繁表达；无CD99表达基本可排除尤因肉瘤。确诊尤因肉瘤依赖于通过原位杂交或更快速的定量聚合酶链反应识别出特征性的染色体易位。截至目前，尤因肉瘤最重要的预后因素是诊断时有转移。目前，对多种治疗方式有应答的局部病变患者的5年生存率超过70%。而肿瘤转移患者的5年生存率不到30%。尤因肉瘤最常见的转移部位是肺、骨和骨髓，但多种器官均可发生转移，包括淋巴结、肝脏和脑。转移部位局限于肺的患者，其预后优于转移至骨或骨髓的患者。无转移的情况下，肿瘤部位是最重要的预后因素，患近端原发肿瘤（即骨盆和骶骨肿瘤）的患者，其预后比远端肿瘤患者差。预后不良的其他临床指标包括原发肿瘤较大，诊断时年龄较大（＞18岁），血清乳酸脱氢酶水平升高。FET和ETS基因家族尤因肉瘤的突变负荷低，每百万碱基有0.15个突变，是所有恶性肿瘤中突变率较低的。界定本病的遗传改变是会导致尤因肉瘤断裂点区1编码基因（EWSR1）和转录因子E-26（ETS）家族成员编码基因之间发生融合的几种可能的染色体相互易位之一。约85%～90%的病例携带染色体易位t(11;22)(q24;q12)，它导致EWSR1与Friend白血病病毒整合蛋白1（FLI1）编码基因发生融合（图2）。在大约1/4的病例中，唯一可检出的遗传事件是染色体易位，因此支持以下观点：产生的融合蛋白即便不是导致细胞转化的唯一原因，也是其主要原因。其他基因突变（特别是STAG2和TP53）在诊断时仅发生于少数肿瘤。虽然这些突变可能加速晚期肿瘤的进展，但它们不是启动或维持肿瘤所必需的突变。图2.尤因肉瘤中的FET和ETS融合蛋白EWSR1与FUS/TLS和TAF15共同组成FET（或TET）基因家族，EWSR1编码广泛表达的EWS蛋白。绝大多数尤因肉瘤都有含EWS的融合蛋白，但约1%的肿瘤存在FUS相关染色体易位。用FUS代替EWSR1似乎并未改变尤因肉瘤的表型和行为。EWS、FUS和TAF15都是RNA结合蛋白，它们的结构都是由本质上无序、低复杂性、类朊病毒、富含SYGQ的N-末端反式激活结构域组成，其后是三个不同长度，富含精氨酸和甘氨酸（RGG）的重复序列。RGG1和RGG2由包含87个氨基酸的RNA识别基序分开，RGG2和RGG3由锌指结构域分开（图2）。EWS反式激活结构域由EWSR1前7个外显子编码，在野生型蛋白中基本是沉默的，但因染色体易位而发生C-末端区域丢失后，它会变成高活性。它受到RGG重复序列抑制，这与它们被融合伴侣替代后发生激活是一致的。类朊病毒结构域具有相变特性，其定义为生物系统发生相或状态变化的能力，可能包括从蛋白质溶液转变为组成无膜细胞器的相分离的液体状隔室。为何含有FET家族成员的融合蛋白具有致癌活性仍需进一步阐释，但一种可能性是FET蛋白的相变特性使相关转录因子具有促肿瘤功能。此外，与大多数RNA结合蛋白一样，EWS参与RNA代谢过程中各个方面的调控，体内EWSR1敲除研究表明，EWS参与减数分裂、B淋巴细胞成熟、造血干细胞自我更新、DNA修复和细胞衰老。EWS还在神经元结构、多巴胺能信号通路和中枢神经系统的运动功能中发挥重要作用，并且与各种转录激活因子和抑制因子结合，并通过类朊病毒结构域与RNA聚合酶Ⅱ结合，从而调控转录。EWSR1不仅可以与ETS家族成员的编码基因融合，还可与大量非ETS基因融合，产生与多种软组织肿瘤发病机制相关的融合蛋白。EWSR1-NFATC2、EWSR1-POUF1、EWSR1-PATZ1、EWSR1-SMARCA和EWSR1-SP3可导致与尤因肉瘤类似的罕见未分化圆形细胞肿瘤。这些肿瘤极为罕见，对详细研究其特征造成了障碍，因此关于是否应将它们视为尤因肉瘤，目前仍是悬而未决的争论。其他EWSR1-非ETS融合导致了目前已比较明确的疾病，包括DSRCT（EWSR1-WT1）、黏液样脂肪肉瘤（EWSR1-DDIT3）、透明细胞肉瘤（EWSR1-ATF11）和骨外黏液样软骨肉瘤（EWSR1-NR4A3）。产生非FET-非ETS基因融合BCOR-CCNB3和CIC-DUX的无关染色体易位导致了形态特征与尤因肉瘤类似的肿瘤。这些肿瘤最初被归类为尤因肉瘤，但我们现在已知晓它们的发病机制和生物学特性与尤因肉瘤截然不同。ETS家族27个成员中的至少5个可以与EWS融合，导致尤因肉瘤：FLI1、ERG、FEV、ETV1和E1AF；FLI1见于85%～90%的病例。ETS因子参与分化和细胞周期控制，其活性与多种癌症的发生相关，包括前体B细胞急性淋巴细胞白血病和前列腺癌37。该家族所有成员均有可识别共同核心5-GGAA/T-3DNA基序的DNA结合域，通常称为ETS结合基序。FLI1有两个由FLI1特异性（FLS）序列分隔的ETS结合域。5ETS结构域和FLS序列构成N-末端反式激活结构域，它在融合蛋白中被EWSN-末端反式激活结构域取代，而前者的作用远低于后者。发生染色体易位后，FLI1中包含3’ETS结合域（与EWS融合）的部分发生构象变化，这使得其与野生型FLI1相比可激活更多的基因。随着包含EWS的融合蛋白的表达，肿瘤范围和多样性增加，这提示EWS在细胞转化中起主要作用，而其融合伴侣决定了细胞类型特异性和肿瘤表型。相同的FET-ETS和FET-非ETS融合蛋白可导致不同的肿瘤，因此支持以下观点：发生转化的细胞的特性可调节融合蛋白活性及其所致后果。EWS-FLI1融合蛋白和表观基因组调控EWS-FLI1被发现后不久，研究人员就观察到其可作为异常转录因子发挥作用，包括诱导具有致癌特性的基因发生表达，但与此同时通过目前仍不明确的机制抑制许多基因。不论其作用机制如何，很清楚的一点是，EWS-FLI1在尤因肉瘤的发病机制中起核心作用。清除细胞系中的EWS-FLI1可导致其无法在小鼠中生长和形成肿瘤，而通过基因工程使之表达该融合蛋白的永生化成纤维细胞可在软琼脂中形成集落，并在体内形成与尤因肉瘤类似的肿瘤。观察到EWS-FLI1对某些基因即可产生诱导作用，也可产生抑制作用，这提示其作用方式可能取决于表观遗传机制。表观遗传对基因表达的控制并不涉及核苷酸序列变化，而是依赖于染色质结构的修饰以及DNA对转录因子和转录调节因子的可及性。上述控制是通过染色质重塑（主要由组蛋白修饰引起）、DNA甲基化和非编码RNA表达实现。虽然EWS-FLI1会影响上述所有事件，但其对染色质重塑机制的利用方式为细胞转化受到的癌基因介导的表观遗传指令建立了新范式（图3）。图3.EWS-FLI1在基因表达的表观遗传调控中的作用EWS-FLI1通过改变组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA表达来影响基因表达的表观遗传控制。DNA缠绕的核小体组蛋白可经历多种翻译后修饰，这些修饰引起了与基因沉默（如异染色质或染色质压实）或激活（如常染色质或染色质松弛）相关的染色质结构变化。目前特征最明确的两种影响基因活性的修饰是组蛋白H3的赖氨酸残基乙酰化和甲基化。组蛋白H3的赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）与基因激活相关，而H3甲基化与激活和沉默均相关。因此，赖氨酸9和赖氨酸27的三甲基化（分别为H3K9me3和H3K27me3）是抑制标志，而赖氨酸4的单甲基化、双甲基化和三甲基化（分别为H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3）是激活标志。染色质调节物（CR）包括组蛋白乙酰转移酶（如CBP/p）、组蛋白脱乙酰基酶、甲基转移酶（如混合谱系白血病[MLL]甲基转移酶）和脱甲基酶（如赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1[LSD1]），以及BAF等大复合物，BAF可拮抗多梳家族蛋白对H3K27me3的放置（deposition），从而使染色质松弛。与GGAA微卫星结合时，EWS-FLI1多聚体可募集BAF复合物、CBP/p（可产生H3K27ac）和MLL甲基转移酶（形成H3K4me1，主要位于可与启动子[图中显示的启动子带有H3K4me3和H3K27ac标志]协同驱动基因表达的远端[增强子]调控元件）。这些CR复合物的共同作用是松弛紧实的异染色质（见图片底部），形成常染色质，其中核小体呈串珠样，转录因子可接触到DNA。EWS-FLI1单体与单个GGAA元件结合可导致野生型（WT）ETS因子及相关激活性CR复合物被清除，进而导致染色质压实，相关基因沉默。EWS-FLI1可减少DNA甲基化，从而成为转录因子结合的障碍。DNA甲基化发生于CpG岛（特征是5′至3′链内的鸟嘌呤之前有一个胞嘧啶）内的胞嘧啶残基。在尤因肉瘤中，DNA甲基化减少主要发生于相当于增强子的序列内。EWS-FLI1可抑制对细胞分化有驱动作用的大量微RNA（miRNA）。miRNA引导RISC（RNA诱导的沉默复合物）靶向信使RNA（mRNA），使mRNA降解或抑制其翻译。通过抑制miRNA-（miRNA-靶向许多mRNA，而这些mRNA编码的蛋白可维持细胞可塑性，如SOX2），EWS-FLI1可降低细胞分化能力并促进其多能性。EWS-FLI1可结合共同核心GGAAETS结合位点，这些位点或孤立存在，或在整个基因组中形成微卫星（多次重复）。但EWS-FLI1与单个和重复GGAA元件结合后产生的效应是截然相反的。识别GGAA微卫星后，EWS类朊病毒结构域的相变特性使EWS-FLI1多聚体可以结合并打开原本难以接近的基因组区域，其方式是募集主要ATP依赖型染色质重塑复合体SWI/SNF（交替型/不发酵蔗糖型）（也称为BAF[BRG1/BRM相关因子]），而BAF可调节基因组结构和DNA可及性。此外，EWS-FLI1多聚体可募集对组蛋白3上特定赖氨酸残基的甲基化或乙酰化有催化作用的酶，从而诱导染色质松弛，其中包括混合谱系白血病（MLL）甲基转移酶复合物和组蛋白乙酰转移酶p。通过调控BAF、MLL和p的活动，EWS-FLI1具有先锋因子（pioneerfactor）的作用，可将沉默的染色质区域转换成完全激活的增强子（图3）。这些通常静止的，含有GGAA微卫星的区域在任何生理条件下均未表现出基线活性，如今成为融合蛋白靶基因的主要驱动因子。GGAA重复长度多态性似乎会影响EWS-FLI1功能。长的重复序列（主要在非洲裔人群中发现）与EWS-FLI1的转录激活特性降低相关，这可能能够解释非洲裔人群低于欧洲裔人群的尤因肉瘤发病率。相反，达到单个GGAA元件后，EWS-FLI1单体可取代生理条件下结合的ETS因子及其相关的染色质调节因子（它们可建立活跃的染色质标志），使得受野生型ETS因子驱动的基因发生沉默。EWS-FLI1导致基因沉默的确切机制尚未阐明，但一个可能的解释是EWS-FLI1可与辅阻遏物复合体NuRD（核小体重塑和去乙酰化酶）相互作用；与NuRD复合体相关的组蛋白去乙酰酶和赖氨酸特异性组蛋白去甲基酶1（LSD1）活性可分别去除组蛋白中的乙酰基和甲基，从而降低DNA的可及性。EWS-FLI1介导的新增强子与ETS驱动基因的沉默同时发挥作用，其总体效应可改变部分基因组，使得引起允许细胞转化的基因发生表达。在基因组中相当于推定的增强子元件的区域，DNA甲基化显著减少54，这与通过松弛染色质产生活性增强子一致，并提示DNA甲基化与染色质重塑之间存在同步。与EWS-FLI1表达相关的DNA甲基化模式对尤因肉瘤具有高度特异性。EWS-FLI1也以多种方式影响非编码RNA的表达。一种机制是部分抑制TARRNA结合蛋白2（TARBP2）活性，而TARBP2活性与微RNA（miRNA）的加工有关，因此其受到抑制会导致多种miRNA成熟减少。另外一种更直接的作用似乎是靶向特定miRNA（包括let-7a、miRNA-30和miRNA-）的表达或成熟。TARBP2和miRNA-受到抑制的最终结果是减少细胞分化，并且促进建立和维持具有高度可塑性的肿瘤细胞亚群，进而驱动尤因肉瘤的肿瘤启动和异质性。EWS-FLI1还可诱导长链非编码RNA（lncRNA）表达，其中一种是EWSAT1，它可通过抑制特定靶基因来促进尤因肉瘤发生。虽然表观遗传重组可以说是尤因肉瘤发生的最重要机制，但其程度至少部分取决于易位发生的细胞环境。尤因肉瘤前体细胞与肿瘤异质性EWS-FLI1表达可诱导大多数非转化原代细胞衰老或凋亡，这提示维持EWS-FLI1表达和功能需要特定的允许性环境。不同研究方法均表明，间充质干细胞或基质细胞提供了EWS-FLI1诱导转化所需的允许性环境，因此是尤因肉瘤的候选起源细胞（图4）。这些细胞起源于间充质，即最终发育成结缔组织和骨骼组织的胚胎中胚层部分，而且这些细胞表现出高度异质性以及在体外分化成多种谱系所需的可塑性。然而，尤因肉瘤也可能起源于具有多能性的其他原代细胞，此外神经嵴细胞也是一种候选起源细胞。图4.FET和ETS融合蛋白的允许细胞尤因肉瘤表现出由低分化细胞亚群产生的肿瘤内明显异质性，这些细胞可启动肿瘤生长并产生不具有致瘤性的子代细胞。这些细胞至少部分依赖于EWS-FLI1的非编码RNA调控，具有癌症干细胞的功能特性，并表达神经干细胞标志物CD和SOX2。单细胞表达谱可用于评估尤因肉瘤模型中的肿瘤内异质性，它凸显了EWS-FLI1表达情况的细胞间起伏。EWS-FLI1hi细胞为高增殖但低迁移，而EWS-FLI1low细胞则是可迁移但增值率低。在单细胞水平对尤因肉瘤模型进行的转录评估显示，EWS-FLI1hi细胞具有增殖和强氧化磷酸化特征，而EWS-FLI1low亚群具有与缺氧相关的特征。因此，肿瘤发展轨迹及基因驱动因子表达水平差异都可能导致尤因肉瘤细胞的表型异质性，这可能给临床治疗带来更大挑战。常规和实验性治疗方法目前，原发性尤因肉瘤的治疗主要依靠细胞毒性药物与局部减瘤疗法（根据可行性实施手术、放疗或两者）的联合应用，该方案已将局部肿瘤患者的5年生存率从化疗出现前的10%提高到目前的70%左右。目前的化疗方案包括旨在缩小原发肿瘤并靶向微转移灶的强化诱导化疗（包括阿霉素、依托泊苷、环磷酰胺、长春新碱和异环磷酰胺），以及之后旨在消除残留细胞的巩固化疗。欧洲研究中心设计出了通过大剂量治疗进行剂量强化，并应用自体干细胞进行挽救治疗的试验，而美国儿童肿瘤学组（ChildrensOncologyGroup）检验了通过缩短给药间隔时间来进行剂量强化。对上述两种策略进行的比较提示，缩短给药间隔时间可能更为有效，而且毒性作用较少。然而，治疗成功的患者有发生长期失能和患其他癌症的风险，特别是与化疗相关的骨髓发育不良综合征或白血病，以及与放疗相关的肉瘤。此外，复发性尤因肉瘤目前仍无法治愈。虽然尤因肉瘤显而易见的治疗策略是直接抑制FET-ETS融合蛋白，但该蛋白缺乏酶活性且结构紊乱，因此现有技术难以将其作为靶点。因此，有效疗法将不得不依赖基于机制的其他方法，如抑制FET-ETS融合蛋白的效应分子，逆转FET-ETS诱导的表观修饰，靶向支持和协同融合蛋白功能的分子和信号通路，或者结合使用上述几种方法。数种候选效应分子已成为治疗靶点，包括受体酪氨酸激酶胰岛素样生长因子I受体（IGF-IR），它是由EWS-FLI1诱导，并且是成纤维细胞转化过程所必需。虽然尤因肉瘤细胞对IGF-IR抑制疗法敏感，但使用抗IGF-IR抗体进行的体内研究显示该抗体的疗效有限。多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）参与DNA单链断裂碱基切除修复，并且在尤因肉瘤中高表达；临床前模型显示PARP抑制剂的疗效很有前景。但临床试验的结果令人失望。小分子YK-4-在体外尤因肉瘤细胞系和异种移植物中的结果均很有前景。YK-4-可抑制RNA解旋酶A与EWS-FLI1之间的直接相互作用，从而破坏剪接体中的EWS-FLI1相互作用，并导致与减少EWS-FLI1具有相似效果的另外一种剪接模式。然而，有限的生物利用度和获得性耐药阻碍了该药的应用。抗生素依诺沙星可增强TARBP2活性，恢复miRNA成熟，它在临床前模型中消除了尤因肉瘤起始细胞，并且与化疗联用具有卓越的协同活性。最后，组蛋白去甲基化酶LSD1参与了EWS-FLI-1的转录抑制作用，LSD1抑制剂在尤因肉瘤细胞系中可选择性地诱导凋亡，目前正在开展临床研究。结论距离发现尤因肉瘤已过去一个世纪，由于积极的多模式治疗，局部尤因肉瘤患者的预后得到了显著改善。但复发和转移性尤因肉瘤的治疗仍是巨大挑战，而且由于无法有效地靶向驱动恶变过程的融合蛋白，需要继续探索基于机制的其他治疗方法。虽然迄今获得的成功有限，但单细胞水平研究有望确定驱动肿瘤的细胞亚群并发现这些细胞亚群的潜在弱点。从尤因肉瘤获得的经验教训不仅在治疗方法方面开辟了新思路，而且为探索独特染色体易位和异常融合蛋白驱动的其他儿童实体癌的发病机制提供了路线图。参考资料1.NEnglJMed;:-DOI:10./NEJMra往期文章精选

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