循环肿瘤DNA与结直肠癌的靶向治疗

转移性结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，结肠癌和直肠癌存在生物学行为的差异，传统化疗不能取得令人满意的效果，即使是靶向药物的加入也往往因耐药限制了有效性。目前，常通过检测肿瘤组织相关的基因突变预测靶向药物的疗效，但存在诸多限制。肿瘤异质性使得单次组织活检并不能完整地代表整体基因改变。外周血作为一个可实时检测的液体活检样本，因取样方便、无创，能开展相应分子标志物检测，目前正受到临床和科研人员的青睐。液体活检用于诊断或检测肿瘤疾病的方法较多，其中循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)能够真实地反映实体瘤组织中的基因突变谱与突变频率，且能实时动态地反映肿瘤的基因改变，即将在多种肿瘤中取代肿瘤组织作为预测靶向药物疗效的样本。

ctDNA的生物学特性及其临床应用

1．ctDNA的生物学特性：

20世纪40年代，Mandel和Metais发现了循环核酸，循环核酸是由机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性核酸。20世纪70年代，Leon等的研究结果显示，肿瘤患者外周血清DNA(cell－freecirculatingDNA,cfDNA)的水平明显高于正常人。20世纪80年代，Stroun等的研究结果显示，cfDNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征，通过对cfDNA中肿瘤特异性畸变(如肿瘤原癌基因和致癌基因突变、微卫星改变和DNA甲基化)的识别，证实其为肿瘤细胞来源的cfDNA，即ctDNA。ctDNA是一类来源于肿瘤细胞的DNA片段，携带有与原发肿瘤组织一致的分子遗传学改变，长度约～bp，含量极少，浓度约5ng/ml，半衰期约0.5～2h，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等液体中，可经尿液和粪便排出。健康人群的cfDNA片段主要来源于凋亡细胞，ctDNA主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞，增殖活跃的肿瘤细胞能主动释放DNA片段到外周循环中。

2．ctDNA的临床应用：

ctDNA应用于临床具有快速、简便的特点，只需采集静脉血，即可对全身的肿瘤基因信息进行测定，用于肿瘤的早期发现和诊断、动态监测肿瘤的发生发展、指导抗肿瘤药物的选择、疗效评估和预后判断等，同时可从中探索肿瘤转移复发和耐药的分子机制，鉴别和筛选新的靶点等。ctDNA可以出现在大部分转移性结直肠癌患者中，这使得结直肠癌靶向表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)药物的个体化治疗成为可能。

ctDNA的定量检测

ctDNA的检测方法包括数字聚合酶链反应(dPCR)、SafeSeqS、珠乳扩磁技术(BEAMing)、实时荧光定量PCR和高通量测序、标记扩增深度测序(TAM－Seq)、全基因组测序、全外显子测序、恶性肿瘤个体化深度测序(CAPP－Seq)等。其检测分为定性和定量2种，定性检测主要检测血清或血浆中肿瘤特异性的基因改变，如基因突变、抑癌基因启动子甲基化等；定量检测则以血液循环DNA总量为指标，两者均可反映肿瘤的存在和严重程度。

有研究显示，不同患者外周血ctDNA的水平差异明显。Newman等的研究结果显示，ctDNA的水平与肿瘤患者体内肿瘤负荷明显相关。当肿瘤患者对治疗反应良好时，ctDNA的浓度呈下降趋势；相反，当肿瘤进展时，ctDNA的浓度不断上升，同时ctDNA中也出现某些特异性基因改变。Tie等的研究结果显示，可通过SafeSeqS技术定量检测治疗前后ctDNA的水平变化来评估肿瘤患者对治疗的反应。该研究纳入53例接受标准一线化疗的转移性结直肠癌患者，定量评估化疗前后的ctDNA水平变化。结果显示，化疗前中位ctDNA水平为16.2%，化疗3d后中位ctDNA水平为14.7%，差异无统计学意义(P＝0.)；而在第2个周期化疗前ctDNA水平就有了明显下降(0.54%，P0.)。这与CT所评估的肿瘤缩减相一致。提示ctDNA水平的变化可以早期预测肿瘤对治疗的反应性。

除定量监测ctDNA的水平变化外，定量监测ctDNA中基因突变水平的变化也可以评估结直肠癌患者对EGFR单抗治疗的反应。Siravegna等通过测定结直肠癌患者不同时间点的K－ras基因突变百分比发现，当加入EGFR单抗后，随着治疗时间的延长，K－ras基因突变量逐渐增加，终止治疗后K－ras基因突变量便开始下降，直到无法检测。由此可见，ctDNA中的基因突变水平也呈现出动态改变。此外，Spindler等发现，ctDNA中K－ras、鼠类肉瘤滤过性病毒原癌基因同源体B1(v－rafmurinecar