IL23可改善CART细胞对实体肿瘤

T细胞可以通过基因工程将肿瘤特异性转化为肿瘤靶向TCR或CAR。TCR-和CAR-工程T细胞分别促进滑膜癌和B细胞淋巴样恶性肿瘤的临床反应。然而，虽然在B细胞白血病患者体内CART细胞可在体内扩增，在注入后可持续到24个月，但在实体肿瘤中，抑制性肿瘤微环境(TME)通常通过多种途径阻碍T细胞的增殖和持续，例如通过诱导检查点抑制和T细胞代谢饥饿抑制。

T细胞增殖需要最佳的T细胞活化，它整合了TCR-CD3复合物下游的信号，协同刺激分子和细胞因子的结合。

基于CAR的工程通过TCR-CD3复合物和共刺激分子提供刺激，而基于TCR的工程则提供TCR参与，不需要充分的协同刺激。

细胞因子是TCR和CAR工程策略的限制因素。工程T细胞分泌的主要促增殖细胞因子是IL-2，但它可能支持调节性T(Treg)细胞的激活和扩张，从而限制了抗肿瘤作用。

T细胞已被设计成除CAR外，还能表达常见的γ链细胞因子，例如IL-15，它能有效地支持它们的增殖和效应功能，而对Treg细胞的作用有限。然而，这种细胞因子工程可能会产生副作用，因为细胞因子是由大多数T细胞和自然杀伤细胞(NK)表达的，因此需要包括安全开关，以抑制潜在的毒性效应。因此，TME内支持T细胞增殖和存活的诱导性和选择性工程的发展，仍然是对TCR和CAR工程T细胞用于实体肿瘤T细胞治疗的关键。

大多数使用细胞因子支持T细胞免疫治疗的研究都集中在STAT5诱导的细胞因子，如IL-2和IL-15。

在最近的研究中，STAT3信号增强了临床前模型中CART细胞效应器的功能，并与慢性淋巴细胞白血病患者更好的临床结果相关。

IL-23是STAT3激活的细胞因子之一，由IL-23αp19和IL-12βp40亚基组成，均由活化的巨噬细胞和树突状细胞表达。

已知IL-23可促进记忆T细胞的增殖，尤其是表达IL-23受体(IL-23R)的辅助型T细胞(TH17)。

特别是，通过将ICOS内域包括在CAR结构中，使CART细胞向TH17方向倾斜，已经被证明可以增强抗肿瘤活性。

这里发现在T细胞中IL-23R和IL-23αp19亚基的活化诱导表达，这使得可以通过用IL-12βp40亚基补充T细胞来将IL-23的释放和活性与T细胞的激活结合起来。

表达p40的T细胞(p40-TD细胞)在T细胞活化后产生IL-23，促进T细胞增殖和存活。

在异种移植和同基因小鼠模型中，在CAR或TCR工程T细胞中加入p40增强了它们的抗肿瘤活性。

p40-TD细胞产生的IL-23主要通过自分泌机制发挥作用，对旁观者细胞的作用有限。

这种方法为TME内过继转移的肿瘤特异性T细胞提供了稳健和选择性的增殖信号。

结论

第一部分：P40工程

TCR-CD28刺激可上调T细胞IL-23R的表达。

首先评估了IL-23R是否在体外扩增的T细胞中表达，且需要遵循临床使用的CART细胞的生产过程，以及扩增的T细胞表型需类似于记忆性T细胞(这里统称为ex-TM细胞，表达CD45RO、CD27和CD28表型)。

(IL-23以激活诱导的方式促进T细胞的增殖)

（a．通过qRT-PCR检测IL-23RmRNA的表达水平；b.通过WB检测其蛋白的表达水平，在人体内0.24,48小时，经过TCR-CD28刺激后T细胞的激活和扩增）解释：即分别从分子和蛋白水平的检测证实了IL-23R（IL-23受体）的表达的上调。

虽然ex-TM细胞在10-12天时在体外扩增，并且表达低水平IL-23R的细胞因子，但抗CD3/CD28抗体刺激ex-TM细胞在mRNA和蛋白水平上都上调了IL-23R的表达(图1a，b)。

IL-23R在ex-TM细胞中的表达是功能性的，因为重组IL-23支持ex-TM细胞的增殖，就像在IL-23R+TH17细胞中观察到的那样，而ex-TM细胞在没有TCR-CD28刺激的情况下对IL-23没有反应(图1c)。

（在没有anti-CD3/CD28刺激时，即使添加了IL-23，也没有ex-TM细胞的增殖；在有anti-CD3/CD28刺激时，添加了IL-23的ex-TM细胞存在明显的增殖。细胞的数目在培养第7天时通过流式检测获得）

分化到TH17：

存在anti-CD3/CD28刺激时：

1.对IL-23有反应的ex-TM细胞没有极化到TH17细胞，因为它们CD4+/CD8+比率与未经处理的T细胞相似。(图1d)：存在IL-23(50ng/ml)或不存在IL-23刺激，D7天的CD4HECD8的比率，相似无区别。

2.CD4和CD8细胞细胞因子的检测(图1e)：存在IL-23(50ng/ml)或不存在IL-23刺激，相似无差别。

3.并显示出T-bet（TBX21）和RoRγT(RORC)的表达，与未处理的细胞(图1f)相似。

这种Th17极化的缺乏可能归因于前TM细胞的可塑性受限或需要额外的Th17细胞因子，如转化生长因子β、IL-6和IL-1β。

IL-23的这种可选择性活性而不偏向激活致病的TH17亚群，促使了探索是否可以利用IL-23/IL-23R轴来支持TME内激活的T细胞的增殖。

T细胞中IL-23/IL-23R的功能

补充：IL-12的βp40(IL12B)亚基和IL23的αp19（IL23A）亚基会通过二硫键结合，激活信号通路stat1-4，诱导细胞因子产生，使得初始CD4细胞分化为TH17，引发炎症反应。

出乎意料的是，观察到前TM细胞在TCR刺激下上调了IL-23αp19亚基，而未见IL-12βp40亚基(图1g)：QRT-PCR方法检测，TCR-CD3/CD28抗体激活的ex-TM细胞中IL-23αp19（IL23A）和IL-12βp40(IL12B)的mRNA的表达水平。

IL-23R和IL-23αp19亚基可在体外TM细胞中的诱导表达，为IL-12βp40亚基的基因工程提供机会，从而在TCR刺激下产生和利用IL-23。

本研究通过γ-逆转录病毒途径将p40亚基添加到ex-TM细胞中，生成p40-TD细胞。

P40-TD细胞在TCR刺激下分泌IL-23(图1h)：elisa检测在CD3/CD28抗体激活的CtrlT细胞和p40-TD细胞在0、24、48小时的IL-23的分泌。

p40-TD细胞释放了有限的IL-12(~pg/ml-1×细胞)，这是一种与IL-23共享p40亚基的细胞因子图1h)。

相对于Ctrl细胞，p40-TD细胞对TCR-CD28的激活表现出明显的增殖作用(图1i)。

IL-23介导的p40-TD细胞反应需要内源性IL-23α亚基，加入IL-23AmRNA的RNA(ShRNA)可抑制p40-TD细胞的IL-23产生(图1j)和IL-23介导的T细胞增殖(图1k)。

j:检测活化的Ctrl和p40-TD细胞分泌的IL-23，这些细胞与编码对照shRNA(sh-Ctrl)或IL23A靶向shRNA(sh-IL23A)的载体共转导。K：细胞计数在第5天，细胞被编码sh-Ctrl或sh-IL23A的载体介导的抗CD3/CD28抗体激活。检测细胞数。（解释：分别干扰对照Ctrl细胞和p40-T细胞的IL-23mRNA，利用CD3/CD28抗体激活后，检测其IL-23的细胞因子分泌和细胞增殖，发现，加入干扰基因并激活后，ctrl细胞仍有较多IL-23分泌且细胞增殖正常，相比p40-T细胞IL-23分泌较低且细胞增殖也较低，证实了IL-23的IL-23αp19（IL23A）亚基对于记忆T细胞增殖和IL-23分泌的重要性。）

有研究显示肿瘤活检组织中IL23AmRNA水平升高，提示IL-23在肿瘤进展中可能起作用，尤其是结直肠癌(CRC)。

然而，由于IL-23是一种异源二聚体蛋白，因此IL-23α和IL-12β亚基必须同时存在于同一细胞中才能产生和释放IL-23。（上文的补充，两亚基的二硫键结合）

肿瘤基因组图谱(TCGA)中的RNA-seq数据分析结果显示，在许多肿瘤标本中，IL23A表达上调，而在肿瘤和正常组织标本中，IL12B转录几乎不能检测到(图1l)，预示体内环境中没有IL-23。

用qPCR和elisa分别检测18例肿瘤组织(CRC、胰腺癌和乳腺癌)IL-23亚基的mRNA和蛋白水平。IL23A（对应亚基P19）基因在CRC肿瘤组织中表达上调，而IL12B（对应亚基P40）未表达(图1m)，而从CRC标本获得的上清液中大部分未表达IL-23(图1n)。（解释：在结直肠癌中，qPCR检测存在IL-23A的表达，而缺乏IL-12B的表达，无法生成二聚体，则上清液中，elisa未检测到IL-23细胞因子的表达）

因此，T细胞的IL-23p40工程（即在记忆T细胞中添加IL-23B亚基的基因）可能在TME（体内）内以TCR激活依赖的方式支持T细胞的增殖，而TME中的IL-23被诱导结合。

第二部分

活化的p40-Td细胞的转录组分析揭示了STAT3和缺氧基因富集的特征。

首先进行了RNAseq（RNA-seq即转录组测序技术，就是把mRNA，smallRNA，andNONcodingRNA等或者其中一些，用高通量测序技术进行测序分析，反映出它们的表达水平）分析，以确定与p40-Td细胞有关的分子通路。

在没有TCR刺激的情况下，Ctrl细胞和p40-Td细胞有相似的基因表达谱(图2a-左图)。

火山图：即高通量测序的差异基因数据分析；横坐标采用倍数法：适用于没有生物学重复的样本，其计算基因在两个条件下表达水平的比值，确定比值的阈值，将绝对值大于此阈值的基因判定为差异基因。纵坐标采用参数分析：P-value，统计学检验变量，代表差异的显著性，一般P-value小于0.05代表着有显著差异性。

Ctrl和p40-TD细胞抗CD3/CD28抗体激活前(左)和激活后5d(右)的基因表达图。火山图是利用log2(倍数变化)和-log10(FDR)值为所有基因构建的。红点代表基因表达上的双倍变化(向上或向下)，（灰色部分为无差异基因，右图红色部分表示出现差异基因）。

相比之下，p40-TD细胞经TCR激活后，表现出与Ctrl细胞不同的分子特征(图2a-c)。

b.刺激Ctrl和p40-TD细胞前后差异表达基因的数目。

c．活化Ctrl和p40-TD细胞的组成成分分析(PCA)。：PCA即利用降维度思想，将多指标转化为少数几个综合指标来分析，图中variance方差分析，可见激活后在细胞的分子组成上，p40-TD出现了显著的差异性。

以上结果表明TCR刺激可充分发挥IL-23、IL-23R在体外TM细胞中的作用。

基因集富集分析(GSEA)显示活化的p40-TD细胞中的STAT3上调基因和Ctrl细胞中的STAT3下调基因(图2d)显著富集，提示p40-TD细胞的STAT3活性升高。用‘STAT3上调’(UP)和‘STAT3下调’(down)基因组和基因表达热图比较活化的Ctrl细胞的表达谱。

（解释：显示在激活之后，p40-TD细胞的STAT3上调，而Ctrl细胞的STAT3下调，利用GSEA，即基因探针富集情况分析，发现上调富集（渐红）在p40-TD细胞，下调富集（渐蓝）在Ctrl细胞）

STAT为信号转录激活蛋白（能与DNA结合的蛋白质家族，磷酸化后形成激活因子），IL-23的P19亚单位可结合T细胞上的受体IL-23R，激活STAT3信号通路，诱导初始CD4细胞分化为TH17。

通过检测活化的p40-TD细胞(图2e)中STAT3磷酸化的增强和STAT3调控基因(SOX2、SOCS3、CEBPD、ABCA1、IFIT1、IFIT3、USP18和CDKN2B)的差异表达(图2f)，验证了该信号的分子特征。

e，TOP：典型的WB显示在p40-TD细胞中STAT3和STAT3磷酸化的增加，与Ctrl细胞相比较，在刺激前和刺激5d后用抗CD3/CD28抗体激活。下图：磷酸化STAT3的密度测定仪，激活后D5在p40-TD细胞中有明显的增高。

f，qRT-PCR定量表达上调(红色，p40-TD)和下调(蓝色，Ctrl)基因的富集与STAT3通路相关。

此外，在TCR刺激的p40-TD细胞中，缺氧标记基因的上调富集(图2g)；

p40-TD细胞中低氧诱导因子(HIFs)和其他HIF靶基因的mRNA表达上调（qRT–PCR），相比于ctrl细胞中(图2h)。

总体而言，这些数据突出显示了p40-TD细胞中STAT3通路在TCR刺激过程中的激活，表明IL-23在这些细胞中起着主导作用。

第三部分

P40的表达增强了CART细胞在实体瘤移植模型中的抗肿瘤活性p40表达增强神经母细胞瘤模型中CART细胞的抗肿瘤活性。

评估IL-23p40在CART细胞中的表达是否提高了它们的抗肿瘤活性。

以人神经母细胞瘤细胞株(LA-1和CHLA-)为研究对象，采用重复肿瘤共培养法研究CART细胞体外抗肿瘤作用。在此应激培养条件下，CAR.ctrl细胞在第一或第二轮共培养后未能控制肿瘤生长，而CAR.p40-td细胞仍有效(图3a，b)。

与对照T细胞(Ctrl)、GD2特异性CART细胞(CAR.Ctrl)或GD2特异性CART细胞(CAR.p40-TD)重复共培养(1~3、R1-R3)后，L.a，b，LAN-1(a)和CHLA-(b)神经母细胞瘤肿瘤细胞计数。

同时，CAR.Ctrl细胞在每一轮共培养后逐渐减少，而CAR.p40-TD细胞数目较为稳定并保持CAR表达(图3c、d)。

在a和b所示的每一轮重复共培养后，T细胞计数。

此外，CAR.p40-TD细胞在单个细胞水平上表现出优越的效应功能，特别是CAR。

P40-TD细胞表达较高水平的裂解酶颗粒酶B：颗粒酶是细胞毒性T淋巴细胞CTL和自然杀伤细胞NK细胞颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称，其中颗粒酶B是主要的效应分子，它可进入靶细胞，激活caspase级联反应，迅速引起包细胞DNA的断裂，导致细胞的快速凋亡。(图3e)；

与CAR.Ctrl细胞比较减少了细胞耗尽标记物Pd-1（程序性死亡受体）和CD的表达，图3f。

CD(CD分子)是一个蛋白质编码基因，与CD相关的疾病包括组织细胞增多症和组织细胞增生症。与其相关的途径有先天淋巴样细胞分化途径。该基因的一个重要同源基因是PTGFRN。对CD3诱导的T细胞增殖有抑制作用。抑制活化T细胞表面IL2RA的表达和IL2的分泌。抑制IL2产生和细胞增殖所需的酪氨酸激酶。抑制磷脂酶C-γ-1/PLCG1磷酸化和随后CD3诱导的细胞内游离钙变化。防止活化T细胞的核因子向细胞核移位。通过皮肤树突状细胞分泌IL10抑制T细胞增殖。可能是CD4(+)CD56(+)白血病肿瘤细胞的标志物。

CAR.Ctrl和CAR.p40-TD细胞在第1轮末颗粒酶B的细胞内染色，图e。

与LAN-1肿瘤细胞重复共培养1、2轮后，Pd-1和CD在CAR.Ctrl和CAR.p40-TD细胞中的表达。

此外，CAR.Ctrl细胞经反复刺激后，产生IFN-γ和TNF-α的T细胞百分比逐渐降低，而CAR细胞则是功能耗竭的指标之一。p40-td细胞继续产生干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(图3g)：P40-TD细胞与LAN-1肿瘤细胞共培养第1轮和第2轮。

在NOD-SCID-IL-2Rnull(NSG)小鼠转移性神经母细胞瘤模型中，CAR.p40-TD细胞与CAR.Ctrl细胞(图3h-k)相比，有较好的剂量(2×个)。

转移性神经母细胞瘤异种移植模型的原理图；代表肿瘤生物发光的两个独立实验。IVIS，成像(使用IVISLuminaII在体内成像系统)。两个独立实验的肿瘤生物发光动力学(Ctrl组8只，CAR.Ctrl和CARP40-TD组每组9只))。粗线描绘出平均折叠随时间的变化，而细线显示每一只鼠的数据。生存曲线总结两个独立实验(每组8只小鼠)。

h小鼠实验流程，j图和i图成像系统显示小鼠体内肿瘤大小的变化，k图为三组小鼠的生存曲线，可见CARP40-TD组小鼠的肿瘤变化平缓，且生存时间较长。

与此相一致的是，CAR.p40-TD细胞在体内外周血、脾脏和肝脏中表现出明显的初始扩张(第10天)(图3l)，并在杀死小鼠时在同一器官中表现出较长的持续时间(图3m)。CAR.p40-TD的增殖和ex-TM细胞较高。

l.输注T细胞后10d血、脾、肝中人T细胞的数目。M组小鼠血、脾、肝中CD3+CD45+细胞的百分比(Ctrl组、CAR.Ctrl组和CAR.p40-TD组分别为T细胞输注后18、22和52d)。

在荷瘤小鼠体内应用4×个CAR-T细胞时，CAR.Ctrl和CAR.p40-TD细胞均促进肿瘤消退(图3n-p)，但只有接受CAR.p40-TD细胞的小鼠在T细胞治疗4周后能免于肿瘤再复发(图3n-p)。

n图：转移性神经母细胞瘤异种移植模型小鼠实验流程图。o图：肿瘤生物发光的检测，发现CAR.Ctrl和CAR.p40-TD两组小鼠的肿瘤都有消退（d7到d21天）。但结合p图，发现在d21天后，第4周时CAR.Ctrl组小鼠的肿瘤存在复发，而CAR.p40-TD没有。

此外，p40过表达所提供的增强的抗肿瘤活性并不局限于与IL-7和IL-15体外培养的CART细胞，也不局限于编码CD28共刺激结构域的CART细胞，，以b7-h3抗原为靶标的CAR.p40-td细胞的抗肿瘤活性在PDAC模型中也得到证实。与CAR.Ctrl细胞相比，P40-TD细胞在应激共培养条件下对人PDAC（胰腺导管腺癌）细胞系BXPC-3具有更好的抗肿瘤作用和较好的持久性(图4a，b)。

B7-H3又名CD，也是一个在细胞表面表达的免疫检查点分子，能减少T细胞释放干扰素，并减弱自然杀伤细胞的细胞毒活性，起到免疫负调节的作用。B7-H3蛋白在正常人体组织，如前列腺、乳腺、胎盘、肝脏、结肠和淋巴器官中表达很少。但是，近期却发现其在很多恶性肿瘤中异常地高表达，且与多种癌症的不良预后相关，包括胰腺导管腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、肾透明细胞癌等。于是，研究人员试验了抑制肿瘤B7-H3的效果，发现B7-H3单抗在肿瘤小鼠中表现出了明显的抗肿瘤活性，随后，几个I期临床试验也显示其安全性良好，显然，B7-H3是一个很具潜力的CAR-T靶点。

分别与CtrlT细胞、B7-H3特异性CART细胞(CAR.Ctrl)、或B7-H3特异性CART细胞(CAR-p40-TD)重复共培养1：2(左)或1：5(右)，计数胰腺癌(BXPC-3)细胞。

此外，在一种使用BXPC-3细胞的原位PDAC模型中，与CAR相比，CAR.p40-TD细胞具有更强的抗CART细胞效应的能力和较好的抗肿瘤作用，Ctrl细胞(图4c-g)。

因此，CAR-T细胞的p40工程促进了抗肿瘤活性，维持了T细胞的持续和扩增。

c，小鼠胰腺癌模型的实验流程图

d，e小鼠肿瘤生物发光的两个独立实验(n=8只小鼠/组)。两个独立实验的肿瘤生物发光动力学检测。

f，两组独立实验的Kaplan-Meier生存分析(每组8只)。

g，T细胞输注后第60d，小鼠血、脾、胰腺中人CD3+CD45+细胞的比率。

第四部分

p40在小鼠T细胞中的掺入，促进了IL-23在黑色素瘤和胰腺癌同基因肿瘤模型中的局部作用。

为评价(IL-23)对小鼠免疫功能的影响，建立了同基因肿瘤模型（新免疫疗法的临床前研究要求体内模型具有充分的免疫功能，同基因肿瘤模型是来源于来自同一近交系的小鼠，利用永生化癌细胞系的建立的同种移植瘤。用以评估新的单一药物和联合免疫疗法）

首先证实，IL-23r和IL-23a，而不是IL-12b，可在体内外诱导的小鼠T细胞中表达，类似于过继性T细胞转移而产生的人类ex-TM细胞(图5a，b)用抗CD3/CD28抗体重复刺激小鼠脾T细胞0，24，48h后，qRT-PCR法检测IL23a和Il12b(a)和Il23r(b)在小鼠脾T细胞中的表达。

将小鼠IL12b基因导入小鼠T细胞后，可在体外诱导IL-23分泌(图5c)，增强T细胞体外扩增(图5d)：图c和d中明显mp40的T细胞有更高的IL-23表达和更好的T细胞增殖。

利用B16-OVA黑色素瘤小鼠模型和体外扩增的OT-1T细胞过继转移法检测了表达p40亚基的小鼠T细胞的抗肿瘤作用(图5e)。

当B16-OVA荷瘤小鼠接受OT-1T细胞亚最适剂量(1×个/只)处理时，表达p40的OT-1T细胞(OT-1-MP40-TD细胞)比转染空载体的OT-1T细胞(OT-1-EV细胞)表现出更好的肿瘤控制能力(图5f，左)。大剂量OT-1-MP40-TD细胞(每只小鼠2×个细胞)在接种肿瘤后30d内可持续控制肿瘤(图5f，右)。

值得注意的是，IL-23只从肿瘤获得的上清液中检测到，而在接受OT-1-mp40-td细胞处理的小鼠血清中没有检测到(图5g)

相应地，在小鼠体内注入OT-1-mp40-Td，可观察到CD8+OT-1T细胞在肿瘤内的比例较高，但在血液、脾脏或肿瘤引流淋巴结(DLN)中则无明显变化，其频率与接受对照OT-1-EVT细胞的小鼠相似(图5h)。

此外，血液、脾脏、肿瘤或dLN（淋巴结）中CD4+、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或髓样细胞的百分比，相比于普通的OT-1-EV，工程性OT-1-mp40-Td的组成无明显变化(图5i)。

为了进一步验证次CART细胞的使用方法，使用先前建立的同基因PDAC模型和B7-H3特异性的CART细胞(图5j)。

小鼠肿瘤模型构建：表达小鼠B7-H3的KPCPDAC肿瘤细胞系在C57BL/6小鼠体内进行了原位移植。

移植的肿瘤有一个完整的免疫微环境，包括B细胞、Treg细胞、巨噬细胞、Gr1+髓源性抑制细胞和肿瘤相关成纤维细胞。植入后，利用表达B7-H3特异性CAR的小鼠T细胞(B7-H3.CAR.EV)或编码小鼠p40亚基的细胞(B7-H3.CAR.mp40-TD)对比治疗。

B7-H3.CAR.mp40-TD细胞对肿瘤的抑制作用明显优于B7-H3.CAR.EV细胞(图5k)。由此证明，在表达肿瘤特异性TCRr或CAR的小鼠T细胞中，p40基因工程发挥了局部作用，增强了抗肿瘤活性，而不影响其他免疫细胞成分（结合图i）。

第五部分

此外，经过研究还发现，与IL-18或IL-15基因工程的CART细胞相比，p40修饰的CART细胞具有更好的抗肿瘤效果和安全性。

工程性IL-23的主要作用模式。

为了更好地验证IL-23在p40-表达T细胞中的作用方式，将p40-TD细胞与截短型NGFR(NGFR+)标记的p40-Td细胞混合，与以1：1比例标记的CD19(ΔCD19-TD)标记的对照组T细胞混合，并用抗CD3/CD28抗体刺激混合细胞(图6a)。

在两种细胞具有相同的含IL-23的培养基培养，发现表达的IL-23R水平相当(图6b)，虽然对于外源性的IL-23的刺激两种细胞有相同的反应，但p40-td细胞比ΔCD19-td细胞的增殖更多(图6c，d)

ΔCD19-TD细胞、CAR.p40-TD细胞与靶细胞LAN-1混合。CAR.p40-TD细胞对肿瘤细胞的反应优于对照组(图6e，f)。：ΔCD19(CAR.ΔCD19-TD)或p40(CAR.p40-TD)与LAN-1肿瘤细胞共培养，在第一、第二轮共培养结束时检测到NGFR+和CD19+CART细胞的百分率。

为了进一步研究IL-23在p40-TD细胞中作用，评价了p40-TD细胞产生的IL-23是否优先结合p40-TD细胞表达的IL-23R，而不是旁观者细胞表达的IL-23R。

构建了p40-GFP融合蛋白，能够跟踪T细胞产生的IL-23(p19和p40-GFP异二聚体)的位置(图6g)。

将p40-GFP(p40-GFP-TD细胞)与ΔCD19标记的对照T细胞共培养，用抗GFP抗体与远红色荧光色素结合检测p40-GFP融合蛋白的细胞表面结合情况，以区分p40-GFP蛋白与细胞内GFP信号的真正细胞外结合(图6h)。

流式和共聚焦显微镜

TCR刺激后，流式细胞仪(图6i)和共聚焦显微镜(图6j)显示p40-GFP-TD细胞表面有大量的绿色荧光蛋白结合，而不在ΔCD19-TD细胞上，即p19和p40-gfp异二聚体在培养液中都能很容易地检测到(图6g)。

这些数据证实了IL-23优先与产生它的T细胞结合。

IL-23优先结合于产生IL-23的T细胞的一个可能解释是，IL-23在扩散前被p40-TD细胞的IL-23R捕获。为了验证这一假设，使用可溶性重组人IL-23R(rhIL-23R)与IL-23结合，阻碍其与T细胞表达的IL-23R发生接触。

通过流式细胞术(图6k)和共聚焦显微镜(图6l)，发现，即使扩散中的IL-23完全被隔离，p40-GFP与p40-TD细胞的表面结合仍保持不变。

用流式细胞仪(k)和共聚焦显微镜(l)检测可溶性rhIL-23R存在或无可溶性rhIL-23R时，p40-GFP在p40-GFP-TD细胞上表面的结合。

此外，rhIL-23R不影响IL-23介导的p40-TD细胞的增殖(图6m)，

综合来看，这些数据显示了IL-23的自分泌作用模式，旁观者细胞的影响有限。

总之，此研究描述了一种新的策略，将高度调控的细胞因子信号通路整合到肿瘤特异性T细胞中，从而提高其疗效。此方法有很大的潜力，因为它既可以用于CAR和TCR工程T细胞，也使得TCR和CAR激活且上调IL-23R和p19亚基，促使内源性p19亚基可与外生表达的p40亚基耦合。

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