液体活检在结直肠癌诊断中的应用进展

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来源：肿瘤医学论坛

作者：李恒震张艳桥(哈尔滨医院消化道肿瘤内科)

癌症是导致人类死亡的重要原因之一，结直肠癌(CRC)作为全球第三大常见癌症，每年会导致约80万人的死亡，严重威胁着人类健康。近年来，随着环境等因素的影响，我国CRC的发病率呈现逐年上升及年轻化的趋势。局限期CRC患者(Ⅰ期和Ⅱ期)5年生存率接近90%，而伴有远处器官转移的晚期CRC患者生存率仅为13.1%，而且CRC起病隐匿，约1/4的患者在首次确诊时就已经发生了转移，在这个阶段，只能选择姑息性治疗，生活质量较差且预后不良，治疗相关的经济负担也显著增加。因此，实现CRC的早期诊断在疾病诊疗体系中具有重要地位，有助于疾病的早期干预和治疗，可以显著改善患者预后，降低死亡率。

针对CRC人群，目前临床常用的筛查手段主要是肠镜检查、粪便隐血试验、肿瘤标志物检测和影像学检查等。肠镜检查可以直接观察肿瘤的位置及形态，获取病变组织进一步行病理学检查，是目前确诊CRC的金标准，但是其存在有创性、受术者操作水平的影响，在临床应用过程中仍存在一定局限性。粪便隐血试验及肿瘤标志物对CRC的诊断缺乏敏感性和特异性，而影像学检查对微小残留病灶和隐匿性转移瘤难以识别。由此，液体活检应运而生并有望弥补这些检查的不足。液体活检是通过对生物源液体(通常是血液)特定成分进行分析，用于癌症诊断、复发监测和预后评估的一种无创活检组织检查技术。液体活检操作方便，可多次重复取样，动态反映疾病变化，避免了肿瘤组织活检的有创性、花费高、结果回报时间长等缺点，一定程度上可以克服肿瘤异质性，更加全面反映患者疾病状态，具有广阔的应用前景。目前，生物源液体特定成分主要包括循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞游离DNA(cfD-NA)、外泌体(Exs)、肿瘤相关血小板(TEPs)及循环肿瘤相关微粒(taMPs)等。本文就上述几种生物源液体特定成分在CRC临床诊断中的应用进行综述，为完善CRC患者的临床诊断提供新思路。

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CTCs

CTCs是从原发肿瘤病灶中分离出来的肿瘤细胞群，可以游离在患者的外周血中。CTCs主要通过血管内活化、上皮－间质转化(EMT)或原发肿瘤的被动脱落而产生。根据上皮细胞和间质标志物的表达差异，CTCs主要分为三种类型:上皮细胞表型、间质细胞表型和混合表型。肿瘤细胞发生EMT后，细胞粘附分子表达减少，获得间充质细胞表型，增强细胞的运动能力，从而促进肿瘤细胞的侵袭和播散，导致肿瘤的早期转移和复发，因此CTCs间质细胞表型的出现意味着患者预后较差。目前CellSearchTM是FDA批准的唯一一种用于CTCs富集的技术，具有较高的特异性，在早期CRC患者中即可以检测到CTCs的存在。因此，循环系统中CTCs的检测有望成为CRC筛查的指标。

Wan等通过分析例肠镜确诊的CRC患者，其中例为癌前病变，发现CTCs检测对癌前病变的诊断敏感性和特异性分别为76.6%和97.3%，例为CRC，CTCs检测诊断的敏感性和特异性分别为86.9%和97.3%。最新研究表明CTCs检出率与CRC患者分期密切相关，Ⅰ～Ⅳ期检出率分别为81.7%、82.4%、91.6%、93.4%，由此可见随着病情的进展，CTCs的检出率会显著增高。与CRC诊断标准临床方案相比，CTCs对包括癌前病变在内的所有CRC疾病阶段的总体诊断准确率为88%，健康对照组的假阳性率为3.3%，癌症患者的假阴性率为16%。由此可见，CTCs检测在CRC的诊断方面是一种潜在的、可行的新措施。此外，随着靶向治疗的兴起，伴随诊断作为一种新兴的体外诊断技术得到了快速发展。伴随诊断通过评估患者特定生物标记物的表达水平，进而评价靶向药物的治疗效果，对患者选择最佳靶向治疗药物具有重要意义。徐建明团队的一项研究入选了36例接受了PD1单抗(IBI)治疗的不同类型消化道肿瘤患者，通过对外周血CTCs进行分析，发现PDL1高表达(PDL1+++)的CTCs数目可以预测PD1治疗效果，而且这类细胞比例越高，响应率也越高，因此PDL1+++CTCs高的患者也具有更好的预后。

02

cfDNA和ctDNA

cfDNA是正常细胞、肿瘤细胞以及循环肿瘤细胞等发生凋亡或坏死后释放到血液中的游离DNA片段，不仅存在于肿瘤患者体内，也可以在健康人群的血液中检测到。cfDNA一旦进入外周循环，半衰期很短，很快就会通过肾脏、肝脏和脾脏从体内清除。因此，cfDNA可以实时反映机体全身情况。其中肿瘤来源的DNA被称为ctDNA，主要通过肿瘤细胞凋亡、坏死、CTCs溶解和肿瘤细胞外的活性分泌进入循环。可以存在于患者的血液、滑膜液和脑脊液等液体中，经尿液和粪便排出。通过测量等位基因突变片段可以获得定量信息，可用于肿瘤诊断并反映肿瘤负荷情况。此外，ctDNA在检测微小残留病灶和隐匿性转移瘤以及监测治疗效果等方面均得到了广泛应用。

Luo等通过前瞻性队列研究验证cfDNA在筛查CRC和高危人群方面的应用价值。该研究共纳入例CRC患者和例正常对照组的cfDNA样本，通过统计方法，以选定的甲基化标志物构建CRC诊断和预测模型，对CRC诊断的敏感性和特异性分别为89.9%和87.5%。预后模型可以有效预测CRC患者的预后和生存期(P＜0.)。同时还发现了一个单独的ctDNA甲基化标志物cg，在诊断CRC和癌前病变时具有高敏感性(89.7%)和特异性(86.8%)。Wan等通过cfDNA全基因组测序建立分类模型对局限期(Ⅰ，Ⅱ期)CRC诊断的AUC值为0.92(95%CI:0.91～0.93)，敏感性和特异性均为85%。Church等对53例CRC患者和例健康志愿者外周血ctDNA基因甲基化水平进行分析发现，血浆SEPT9基因甲基化异常诊断CRC的敏感性为48.2%，特异性为91.5%;对CRCⅠ～Ⅳ期诊断敏感性分别为35.0%、63.0%、46.0%和77.4%，但对晚期腺瘤的诊断敏感性较低(11.2%)。因此，CRC人群筛查试验大规模应用于临床还需要提高对早期癌症和晚期腺瘤诊断的敏感性。

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Exs

Exs是一种细胞通过胞吐方式分泌至微环境中的囊泡，直径为40～nm，具有磷脂双分子层膜结构。人体中几乎所有类型的细胞均可通过内分泌或旁分泌的方式释放Exs。因此Exs广泛存在于血浆、唾液、尿液、母乳、羊水、脑脊液等多种体液中。Exs通过其携带的微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(cir-cRNA)、DNA以及蛋白质等生物活性成分的运输，在细胞间物质交换和信息交流中发挥重要作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞分泌更多的外泌体，而且患者循环系统中的外泌体与肿瘤细胞释放的外泌体具有相似的遗传信息，表明通过对Exs中遗传信息的检测有望成为肿瘤早期筛查的标记物。

与cfDNA相比，Exs携带的基因片段更加丰富而稳定，因此在近几年受到广泛