表观遗传抑制剂与肿瘤

近期新英格兰上发表了题为《EpigeneticTherapiesforCancer》的综述，小分子靶向药的靶点枯竭，越来越多的注意力正在转向表观遗传治疗领域，或者说和表观遗传相关的领域，我这边粗译的一下，没有完全直译，仅作参考。

目录：

介绍正文

表观遗传调控子的突变及其作为靶标的验证

DNA异常甲基化

针对DNA异常甲基化的抑制剂

组蛋白异常甲基化

KMT抑制剂

组蛋白异常乙酰化

HDAC抑制剂

其它在研表观遗传抑制剂

9.1靶向修饰酶，去修饰酶，识别酶和重塑酶

9.2靶向塑形器和绝缘子

10.基于表观遗传抑制剂的联合治疗

11.经验和未来的方向

12.结论

13.补充文件（在研组合临床）

1.介绍正文

靶向染色质是治疗癌症最早的探索方向之一。最早通过改变DNA甲基化改变染色质状态的药物可以追溯到年代。随着肿瘤基因组测序的进展，尤其当发现很多调控染色质的蛋白发生突变，人们对染色质的复杂性以及参与肿瘤发生有了进一步的了解。在很多情况下，这些调控染色质的蛋白发生突变对于维持肿瘤细胞恶质性至关重要，得益于此也有很多新的肿瘤治疗手段涌现。本文总结了已批准的调控表观遗传的药物及其临床活性，并描述了正在开发中的其它治疗手段或药物，以及未来表观遗传学领域的挑战。

表观遗传学主要围绕两个组分，DNA和组蛋白。基本的染色质单位是核小体，由重复的bpDNA包裹的组蛋白八聚体构成。组蛋白家族包括H2A，H2B，H3，H4和其它多种变构体，其中许多具有独特的功能。DNA和组蛋白不同的修饰可以调节DNA的可及性和功能，而这些修饰方式和程度的改变是肿瘤发生的标志之一。针对表观遗传学开发的药物或疗法就是试图使促进或维持肿瘤恶性表型的DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰正常化。

调节胞嘧啶甲基化，以及多种组蛋白翻译后修饰的酶，都会参与调节DNA复制，修复以及RNA转录。组蛋白N端赖氨酸尾巴的翻译后修饰包括乙酰化和甲基化，以及泛素化，磷酸化和磺酰化。尽管存在多种修饰方式，但参与特定组蛋白修饰的调节酶是具有特异性的，例如，H3K9ac表示组蛋白H3的第9个残基赖氨酸（K）发生乙酰基（ac）修饰。H3K9me3表示三个甲基（me3）修饰到同一个赖基酸上。乙酰化和甲基化通常被作为组蛋白标记物，而不指翻译后修饰过程。乙酰化导致染色质处于开放的活性状态，甲基化则更复杂并且具有多种作用，具体取决于修饰的残基。在某些位置，例如H3K9，甲基化与染色质抑制状态有关。在其他情况下，例如H3K4，甲基化与基因转录有关。

参与调节组蛋白翻译后表观遗传修饰的酶分为：修饰酶（writer），识别酶（reader），去修饰酶（eraser）和重塑酶（mover），这些酶系包含超过种蛋白。修饰酶，顾名思义，增加了修饰，包括DNA甲基转移酶（DNMT），组蛋白赖氨酸甲基转移酶（KMT）和组蛋白乙酰转移酶（HATs），而去修饰酶（eraser）就是去除翻译后修饰，包括组蛋白赖氨酸去甲基酶（KDM）和组蛋白去乙酰基酶（HDAC）。识别酶（reader）是指蛋白通过溴结构域或染色质结构域识别组蛋白乙酰化或甲基化残基。重塑酶（mover）是一类染色质重塑蛋白，移动核小体，允许基因转录。（Figure1和Figure2）。

2.表观遗传调控子的突变及其作为靶标的验证

我们对染色质的复杂性及其在肿瘤发生中作用的理解随着数千个癌症基因组的测序和表观遗传调控子的突变的发现而增加。然而，突变本身并不一定会带来功能上的改变，因此也无法鉴定出潜在的治疗靶点。修饰蛋白质的突变可引起肿瘤驱动基因或抑制基因改变，但同时也可以是无意义的一过性突变。随着研究的深入，越来越多的突变类型已经被证实对肿瘤发生很重要（Figure2）。表观遗传调节子的大多数突变会破坏蛋白构象或产生新的终止密码子，从而导致功能丧失，而有少数突变会导致新功能的获得或改变。基因融合和表达水平变化进一步增大了复杂性。所有这些变化突出了表观遗传学研究的一个重要主题：即正确的表观遗传调节需要在正确的时间，在正确的位置，过多或过少都会造成肿瘤发生。

3.DNA异常甲基化

DNA甲基化异常与多种肿瘤的发生有关。在甲基化异常的癌症中，启动子区域或附近的CpG岛被超甲基化。年，在20%以上AML患者的样本中鉴定出DNA甲基转移酶DNMT3A发生突变，其中一半以上的突变发生在R位。然而，随后人们认识到，与野生型DNMT3A相比R突变形式会使催化活性降低，并导致低甲基化。DNMT3A的改变通常作为前期白血病细胞的起始，再此基础上发生其他突变可能会导致恶性克隆的形成。随着肿瘤驱动基因发生进一步突变，会出现明显的白血病亚克隆。母克隆通过缓解和复发而持续存在。

同时还有其他一些分子的变化提示DNA高度甲基化和肿瘤恶性形成相关。一个例子是功能丧失突变，特别是在TET2中，这在AML中很常见。通过催化去甲基的第一步-甲基胞嘧啶向羟甲基胞嘧啶的转化-TET家族的去修饰酶逆转了DNMT1、3A和3B催化的胞嘧啶的甲基化；阻止去甲基过程，会导致异常的DNA超甲基化。TET2改变在CHIP中也很常见。CHIP涉及一个改变的克隆，发生在大约10％的65岁以上的人群中，并且与血液系统肿瘤和冠状动脉疾病有关。另一个例子涉及参与三羧酸（TCA）循环酶的突变，这被认为间接导致DNA和组蛋白超甲基化修饰。在异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）中的R和在异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）中的R处发生突变后改变了酶的活性，并导致竞争性代谢物2-羟基戊二酸（2-HG）的产生（Figure3）。2-HG对TET酶活性具有抑制作用，产生的效果和TET功能丧失突变类似，并导致DNA超甲基化；同时，2-HG对赖氨酸去甲基酶活性的抑制会导致组蛋白赖氨酸甲基化的增加。在琥珀酸脱氢酶和延胡索酸水化酶功能丧失突变中也有观察到类似的现象。

DNMT3A，TET2，IDH1和IDH2在AML中突变率分别为28%，14%，9%和10%，在AILT淋巴瘤中同样发现有类似的基因突变。如果能在实体瘤中发现可能改变DNA甲基化的突变，将会给扩展表观遗传抑制剂到实体瘤治疗上带来希望。但除了在AML中，R突变很少见。在排除AML的情况下，在个TCGA肿瘤样本中仅发现2%具有DNMT3A突变，而在R位点上只有2个突变（Figure3）。TET2突变同样只有2%，包括在一些实体瘤中发生截断型的突变。IDH1R突变略高，约4%，其中78%的为低级别脑胶质瘤，14%的胆管癌和4%的皮肤黑色素瘤。

4.针对DNA异常甲基化的抑制剂

DNMT抑制剂阿扎胞苷和地西他滨在DNA甲基化过程被发现之前就已经开发并获得上市批准。这两种药物都是抗代谢物，当掺入DNA时可以抑制DNMT活性并诱导甲基化程度不足；阿扎胞苷还可以也被掺入RNA中。临床上MDS患者响应率在16%-17%，AML患者响应率为20%-40%，并据此FDA于年批准阿扎胞苷上市。在年FDA批准地西他滨治疗MDS和CML。在欧洲，阿扎胞苷和地西他滨被批准用于治疗不适合移植的新诊断或继发性AML患者。但与此同时，单药治疗实体瘤的有效性数据并不是很让人信服。

尽管TET2，IDH1和IDH2突变会导致DNA超甲基化，但DNMT抑制剂在这种情况下的活性并不能如期望的那样有效，因此并不清楚响应患者是不是由甲基化不足所介导。此外，与所有表观遗传疗法一样，抑制活性并不限制于携带突变的癌症，这可能是因为DNA损伤等机制促进了细胞死亡。

FDA分别于年和通过优先审批和孤儿药批准了两种针对IDH1和IDH2突变的靶向药物：Enasidenib（IDH2）和Ivosidenib（IDH1）。这是首次上市的针对肿瘤代谢产物的靶向药物。每天口服一次，两种药物都可以显著的降低血液中2-HG的水平。在FIH临床中，38.8%的IDH2突变AML患者对Enasidenib具有响应，药物治疗后可以在患者外周血中观察到IDH1或IDH2突变等位基因被清除。经IDH抑制剂治疗后PR患者可以长期获益，要知道AML在之前的治疗中仅有CR才会表现出长期获益，但同时也要注意到IDH抑制剂在治疗不到一年的时间内也会发生耐药，而这种耐药的发生部分可以由于不是所有AML细胞都携带IDH突变来解释。随着数据的丰富，目前还不清楚IDH抑制剂是否对实体瘤有效，尽管IDH1突变在脑胶质瘤中频率很高，至少透过血脑屏障会是治疗该类患者所必须要考虑的点。在一项正在进行的I期临床中，vorasidenib可以很好的透过血脑屏障，并且可以降低脑胶质瘤患者93%的2-HG水平。

5.组蛋白异常甲基化

组蛋白赖氨酸尾巴的甲基化，和DNA甲基化类似，会导致基因沉默，并被认为和肿瘤发生有关。许多KMT修饰酶被认为和肿瘤发生有关，包括EZH2，NSD2，SETD2和DOT1L。比如滤泡性淋巴瘤FL中EZH2的功能获得性突变。Y位点突变降低了H3K27的甲基转移酶活性，但增加了H3K27me2的甲基转移酶活性，抑制三甲基化形式的H3K27me3，并导致基因沉默。其他一些功能获得性突变（例如AG和AV）和功能丧失突变也被认为可以驱动肿瘤，但许多EZH2突变的功能还有待进一步表征（Figure2）。KDM的功能丧失性突变也被报道会改变组蛋白的甲基化状态。

6.KMT抑制剂

已经有多个针对EZH2的药物在开发。Tazemetostat是目前研发进度最快的EZH2抑制剂，其他药物包括valemetostat，CPI-和CPI-。在一项2期临床试验中，Tazemetosta对复发难治非霍奇金淋巴瘤的ORR为35%，持续响应时间13个月，在FL中ORR为69%，持续响应时间11个月，基于该数据年6月FDA批准Tazemetostat治疗FL。但由于EZH2突变在实体瘤中很罕见，因此EZH2抑制剂外推到实体瘤治疗并不那么容易。在个TCGA肿瘤样本中，实体瘤中的大多数EZH2突变似乎都是功能丧失突变，主要为3个Y突变，且都是在皮肤性黑素瘤中，在体外研究中，Tazemetostat可能具有抑制黑色素瘤活性。

Tazemetostat的另一项临床结果也支持监管部门的批准。活跃的基因表达需要使核小体远离DNA，而这时候需要SMARC家族成员的参与，SMARC属于ATP依赖酶，是SWI/SNF染色质重塑复合体的一部分。一些SWI/SNF家族蛋白功能丧失突变会引起失衡，导致EZH2活性异常，H3K27me3甲基化水平增加，以及基因沉默增加。抑制EZH2会打破这种失衡，并导致细胞死亡。这种现象体外在多种SMARC家族蛋白中有观察到，包括SMARCA2/SMARCA4，ARID1A和PBRM1，比如在横纹肌瘤和上皮样肉瘤中普遍存在SMARCB1/INI1缺失和功能丧失性突变，在临床试验中Tazemetostat治疗上皮样肉瘤获得15%的ORR，也因此获得FDA的批准。同样，在滑膜肉瘤中SS18-SSX基因融合会导致SWI/SNF复合体丢失SMARCB1，并使带有这种改变的细胞对Tazemetostat敏感。因此，EZH2的激活，SMARC家庭成员中功能丧失性突变以及SS18-SSX基因融合均会影响H3K27的甲基化状态，这也提供了多种基因改变导致相同表观遗传调节子改变，并导致肿瘤发生的另一个例子。而SWI/SNF复合体其他成员的改变是否也会导致肿瘤细胞对EZH2抑制剂敏感还需要更系统的研究。

7.组蛋白异常乙酰化

组蛋白乙酰化的水平由去乙酰基的HDAC活性和使组蛋白赖氨酸尾巴乙酰化的HAT活性来调节。HDAC去修饰酶家族包含11种HDAC，分为4种酶类：I，IIa，IIb和IV，每种酶均可以被HDAC抑制剂抑制。组蛋白去乙酰基酶实际上一个错误的描述，因为除了定位在细胞核上的I类酶外，HDAC还会使胞质蛋白去乙酰基，因此称为赖氨酸去乙酰基酶会更合适。

去乙酰酶的过表达会导致组蛋白乙酰化程度降低，染色质闭合，基因表达水平降低。与上述其它表观遗传蛋白的致病突变不同，HDAC很少发生突变。肿瘤TCGA数据库中只检测到不到1%的突变率。而过表达更为常见，比如在神经内分泌癌中。相反，HAT突变很常见。而EP和CREBBP的突变通常是功能丧失性突变，可减少组蛋白乙酰化并削弱与其众多转录因子底物的相互作用。

8.HDAC抑制剂

FDA批准四种HDAC抑制剂-Vorinostat，Romidepsin，Belinostat和Panobinostat；中国批准还批准了一款HDAC抑制剂，Chidamide。HDAC抑制剂可以抑制总体的乙酰化水平（例如，H3K9ac，H3K18ac，H3K23ac，H3K56ac，H4K5ac，H4K8ac和H4K16ac）。通过直接结合HDAC，抑制赖氨酸去乙酰化，从而维持HAT活性和超乙酰化水平。乙酰化作用会中和赖氨酸的正电荷，从而降低对带负电荷DNA的静电吸引力，这反过来会松弛染色质，并打开抑制细胞生长或诱导分化表型基因的转录。这一过程被作为HDAC抑制剂发挥作用的经典机制。目前还不清楚是如何选择性进行基因转录，以及是否这就是HDAC抑制剂引起细胞死亡的准确机制。HDAC抑制剂还涉及DNA和线粒体损伤。目前尚不清楚HDAC抑制剂调控胞质蛋白乙酰化的机制，尤其是Vorinostat，Belinostat和Panobinostat，它们以I类和II类HDAC酶为靶标。而II类HDAC会同时参与细胞质蛋白和组蛋白的去乙酰基化，因此II类抑制剂可增强细胞质蛋白的乙酰化水平，而这被认为会有助于激活转录因子（例如TP53和TBX5）并稳定细胞骨架蛋白。与组蛋白乙酰化相比，改变细胞质蛋白乙酰化对细胞功能的影响还不完全清楚。

FDA批准了Vorinostat和Romidepsin治疗皮肤T细胞淋巴瘤，Romidepsin和Belinostat被批准用于治疗外周T细胞淋巴瘤，而Panobinostat被批准与地塞米松联合用于治疗多发性骨髓瘤。Vorinostat和Romidepsin的批准，不仅由于30%和34%的缓解率，还由于可以缓解皮肤T细胞淋巴瘤患者的出肤疼痛和皮肤破损（Figure4）。对于周围T细胞淋巴瘤，Romidepsin和Belinostat都获得了加速批准，1/4至1/3的患者响应良好。对于罗米地辛，中位持续响应时间超过1年。

HDAC抑制剂在T细胞淋巴瘤中的抑瘤活性，以及AILT患者中DNMT3A，TET2和IDH2高频突变，支持某些T细胞淋巴瘤具有相同的表观遗传起源。Romidepsin加阿扎胞苷治疗T细胞淋巴瘤患者响应率也达到73%。但是，AILT中DNA甲基化基因突变并没有在皮肤T细胞淋巴瘤中观察到。与其他例子一样，在没有突变的情况下可以观察到患者对药物响应，同样让对纯表观遗传抑制剂的理解变得更加混乱。

9.其它在研表观遗传抑制剂

9.1靶向修饰酶，去修饰酶，识别酶和重塑酶

在美国，目前有九种表观遗传抑制剂被作为标准治疗药物：2种DNMT抑制剂，4种HDAC抑制剂，2种IDH抑制剂，以及最新获批的EZH2抑制剂Tazemetostat（Figure5）。

目前还有很多的表观遗传抑制剂，比如修饰酶抑制剂，识别酶抑制剂和去修饰酶抑制剂正在开发（Figure6）。口服DNMT抑制剂guadecitabine正在尝试不同的联用组合。其他KMT抑制剂也正在开发中。其中之一就是MLL（也称为KMT2A），menin（MLL支架蛋白）和DOT1L（唯一的H3K79甲基转移酶）之间的相互作用。MLL通过与AF9，AF10和ENL融合发生基因重排，并招募DOT1L到MLL作用靶标，改变表观遗传状态。目前已经有抑制剂阻断DOT1L或DOT1L和MLL-menin的相互作用，但是DOT1L抑制剂Pinometostat作为单一疗法的响应率并不高，提示这种染色质排列紊乱的复杂性。VTP-的临床前活性表明，阻断MLL-menin的相互作用可能要更重要；目前相关抑制剂SNDX-的1/2期研究正在进行（NCT）。

对于组蛋白乙酰化，更特异性的HDAC抑制剂正在开发中，其中包括靶向I型HDAC酶的entinostat；HDAC8特异性抑制剂NBM-BMX；HDAC6特异性抑制剂ricolinostat。CREBBP乙酰转移酶功能丧失性突变的细胞更依赖于P乙酰基转移酶的活性，从而提供了另一种潜在的治疗可能。KDM1A（组蛋白赖氨酸特异性去甲基酶1，LSD1）作用到H3K4，进行去甲基化修饰。H3K4me1或H3K4me2处的甲基化是正常细胞生长和分化的关键标记。LSD1在AML和骨髓增生异常综合征中的过表达降低了H3K4me1和H3K4me2水平，导致基因表达抑制。目前多种LSD1抑制剂正在开发中，包括iadademstat，可以诱导白血病母细胞分化和偶尔的AML反应。其它2个正在开展临床的LSD1抑制剂包括INCB（NCT）和CC-（NCT），都是以联用的方式在进行。

识别酶的溴结构域和染色质结构域分别识别组蛋白乙酰化和甲基化位点。BRD4是BET家族的成员，可读取染色质的高度乙酰化区域。NUT中线癌是BRD4-NUT（睾丸核蛋白）融合的罕见睾丸癌，BET抑制剂molibresib和birabresib已在NUT中线癌患者中表现出抑瘤活性，这也为BRD4抑制提供了概念验证。鉴于BET家族蛋白和很多肿瘤驱动基因过表达相关，目前有多个BET抑制剂正在开发。

9.2靶向塑形器和绝缘子

塑形器和绝缘子作为新的靶点，也在开发相应的药物（Figure2）。对于组蛋白，核小体的塑形器和调节染色质的蛋白质复合物可以发生突变，通过翻译后修饰过程模拟或改变蛋白蛋白相互作用。肿瘤细胞中组蛋白可以发生突变，比如组蛋白H3.3可以作为表观遗传学药物开发的靶标。90%的成软骨细胞瘤和20%的儿童胶质细胞瘤的组蛋白H3.3的36位赖氨酸突变为甲硫氨酸，从而抑制H3K36甲基转移酶活性，包括MMSET和SETD2，从而降低H3K36甲基化水平并改变基因表达情况。

最后，最近在肿瘤中发现了一组新重要的表观遗传调节子。绝缘子是一种DNA-蛋白质复合物，可保护一个DNA区域免受与另一个区域影响，从而防止不适当的启动子-增强子之间的相互作用，以及染色质沉默的扩散。这些蛋白质的作用已在三维基因组结构的背景下进行了研究。绝缘子蛋白CTCF结合特定的DNA序列，在正常细胞中产生相互作用序列。肿瘤细胞中CTCF，DNA序列，或相关蛋白，比如STAG2，RAD21，CHD8的异常，可以导致基因的异常表达。在TCGA数据中的CTCF突变率为2%，其中一半被认为具有促癌作用。

10.基于表观遗传抑制剂的联合治疗

多种疗法正在和表观遗传抑制剂进行联用，包括经典的化疗，靶向疗法，其他表观遗传抑制剂和免疫检查点抑制剂，来提高血液肿瘤患者的响应率，并将表观遗传抑制剂的疗法扩展到实体瘤（见文末补充图表）。通常来说，协同作用很容易在体外试验中证实，但实际上联用效果取决于肿瘤实际的微环境，因此目前为此，临床结果并不如人意。迄今为止，只有Panobinostat，Bortezomib和地塞米松的组合获得FDA的加速批准。因此还需要更深入的表观遗传学研究来指导精准治疗药物的开发和药物组合。DNMT和HDAC抑制剂组合早在年就被确定具有协同作用，但至今为止依然没有临床证据对AML治疗有获益。因此需要更精心的设计，区别不同疾病，靶点，不同药物，来避免早期临床前研究积极结果的陷阱。鉴于Entinostat较长的半衰期，其特别适合开展联合用药研究。最后，有大量的表观遗传抑制剂在和免疫检查点抑制联用，这些都是出于DNMT，HDAC和EZH2抑制剂可以诱导直接参与免疫响应的蛋白表达，而且可以诱导癌症-睾丸抗原或内源性逆转录病毒序列表达。

11.经验和未来的方向

到年，尽管有9种表观遗传抑制剂获批，但大多数血液瘤和实体瘤中表观遗传治疗仍在进行中。表观遗传是一个研究接近50年的领域，其重要性，冗余性，互联性和脆弱性正逐渐成为人们