利用蛋白水解靶向嵌合体PROTAC作

北京专业治疗白癜风医院是哪家 http://www.xftobacco.com/

本次和大家分享来自《cell》的一篇综述。作者是来自耶鲁大学的GeorgeM.Burslem和CraigM.Crews。作者介绍了一个蓬勃发展的技术--靶向蛋白水解（PROTAC），PROTAC可以通过泛素蛋白酶体系统在翻译后层面调节蛋白质的浓度。作者介绍了该技术在药物研发上的应用以及其所帮助实现的新兴生物学发现，提供了该技术的开发和使用流程以及讨论了该技术的优点和问题。最后作者将PROTAC介导的在蛋白质水平上的调节作用与其他技术（例如RNAi和基因编辑）进行了比较。

概述

泛素-蛋白酶体系统

泛素-蛋白酶体系统是摧毁受损蛋白以及不再需要的蛋白的主要的细胞内机制。在三种酶级联反应的帮助下，拥有76个氨基酸残基的蛋白质--泛素以一种翻译后修饰的方式通过赖氨酸形成异肽键连接到靶蛋白上。三种酶包括了E1活化酶，E2结合酶，E3连接酶。在ATP作用下，游离的泛素被E1激活并被转化为C端硫酯，随后通过反硫酯化从E1传递到E2，最后在E3复合物的帮助下（直接或间接的）转移到底物蛋白的赖氨酸上。反过来泛素表面的七个赖氨酸也可以被泛素化，这些翻译后修饰有很多未被研究发现的生物学功能，其中K48聚泛素的一个重要功能就是标记蛋白使得其通过蛋白酶体进行降解。蛋白质泛素化涉及的酶存在于人类基因组中，其中E1只有两种而E3有多个假定的家族成员。E3连接酶募集底物并促进泛素从E2结合酶到目标蛋白的转移。当一个蛋白被poly-K48泛素标记并且被蛋白酶体识别，标记该蛋白的泛素链被蛋白酶体相关的去泛素化酶（DUBs）去除并进入循环利用，而蛋白质底物则展开并被降解。

劫持泛素-蛋白酶体系统

PROTAC技术使化学的方法可以参与到泛素-蛋白酶体系统中，并旨在降解特定的目标蛋白质。该方法采用了E3连接酶配体，通过柔性的化学连接子来和靶蛋白融合引起异位泛素化，诱导蛋白降解。从细胞内肽配体裂解物的概念验证实验开始，该技术逐步成熟，已经常用于细胞和体内实验，甚至进入临床试验。重要的是，该技术现在由合成的模块化化合物组成，这些化合物可针对广泛的蛋白质类别以及在不同的亚细胞位置发挥作用，包括细胞质，细胞核和血浆膜。随着我们更好地了解这项新技术，我们发现，新底物与E3复合物之间的蛋白质-蛋白质相互作用是PROTAC成功的关键决定因素。如图2所示Farnaby等人（）和Roy等人（）通过合作在该领域的结构和生物物理表征方面做出了贡献。仅少数E3连接酶已用于PROTAC技术，由于可以使用能够招募E3连接酶CRBN或VHL的类药物小分子来招募这两种酶，大多数报道的化合物都是基于使用这两种酶。细胞凋亡抑制剂（cIAP）配体也被使用过，但通常会导致自身泛素化和E3连接酶本身的降解。使用nutlin化合物募集MDM2在开发首个全小分子PROTAC中起过关键作用，最近又重新出现并成为靶向蛋白质降解的有效方法。E3超家族拥有多个假定成员，令人兴奋的是看到新E3连接酶的配体出现及其在靶向蛋白质降解中的应用。事实上，由于它们的局限性，其中一些新的配体只能在特定的细胞区域中协助降解。鉴于E3/靶蛋白相互作用在PROTAC介导的降解中的重要性，获得更多可供招募的E3可以为PROTAC的成功开发提供机会。

Figure1.SchematicRepresentationoftheUbiquitinCycleandHowItCanBeCo-optedbyPROTACs

应用

PROTAC技术已应用于生物开发和药物开发。它们是实验室里用于研究蛋白质在生理系统中作用的有力工具。此外，PROTAC的小分子性质避免了与传递相关的问题和生理分布所导致的阻碍临床siRNA应用的问题，从而引起了制药行业的极大兴趣。

药物开发中的PROTAC

毫不奇怪，考虑到它的小分子的特性，PROTAC技术正在进入多种适应症的临床中。初步研究专注于激素受体特别是雄激素受体的和雌激素受体的降解，值得注意的是这些试验是针对口服生物利用性PROTAC的，彰显了PROTAC优于治疗性RNAi或传统选择性雌激素下调剂（SERD）的优势。

雄激素受体

雄激素受体（AR）拮抗剂，例如恩杂鲁胺，已在前列腺癌患者的治疗中显示了良好的效果；但是经常会产生耐药性。AR的PROTAC已多次显示优于恩杂鲁胺的效果，尤其是在雄激素水平升高或AR突变引起拮抗剂变成激动剂的耐药情况下。AR的PROTAC分子ARV-目前正在转移性耐药前列腺癌的临床试验中。

雌激素受体

雌激素受体降解剂（SERDs）证实了诱导雌激素受体（ER）降解是一种治疗策略，氟维司群被食物和药物管理局（FDA）批准用于治疗乳腺癌。然而，ER的PROTAC比氟维司群诱导更有效，并且具有更佳的药理性质。ER的PROTAC--ARV-目前正在临床试验中，用于晚期或转移性ER+/Her2乳腺癌。

BRD4

Bromodomain和Extraterminal（BET）域表观遗传蛋白BRD4可能是最常见的PROTAC靶向蛋白，经常被用作蛋白质降解技术开发的测试底物。使用PROTAC靶向BRD4特别有吸引力，因为BRD4的降解导致了相对于简单的BRD4抑制而言更加多的c-Myc损失从而导致各种癌细胞的凋亡，这种效果在体内和体外都存在。确实，靶向BRD4的PROTAC似乎是临床前模型中继发性急性髓细胞性白血病（AML），多发性骨髓瘤，套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤和耐药性前列腺癌的潜在疗法。有趣的是，BRD4的PROTAC也已被用在PROTAC耐药机制的测试平台中，揭示了对于VHL招募的PROTAC的耐药性可能是由于Cul2的丧失而引起的，而CRBN招募类型的PROTAC处理过的细胞可能会失去CRBN或其同源E2，UBE2G。在将PROTAC开发为治疗药物时应考虑这些耐药机制。

Figure2.CompositionofaPROTACforBRD-4

靶向聚集蛋白

蛋白质降解的一个具有挑战性但可能非常令人兴奋的目标类别是易于聚集的蛋白质，例如α-突触核蛋白，运甲状腺素蛋白和tau。通过PROTAC直接募集到E3连接酶对这些蛋白以单体或聚集状态进行降解是治疗蛋白质聚集疾病的诱人方法。一些PROTAC研究已经通过诱导tau降解开始挑战这一领域。

PROTAC促成的生物发现

除了用作潜在药物外，PROTAC还是研究蛋白质功能的独特工具，把小分子具有的优势和基因沉默或编辑技术结合。最重要的是，它们可以研究急性蛋白质损失，而不是逐步选择无需特定蛋白质即可存活的细胞，避免来自补偿途径或重新编辑中出现的问题。PROTAC也可用于其他技术可能不适合的患者样本中。以下是PROTAC能有所帮助的生物发现。

不依赖BCR-ABL的CML干细胞

伊马替尼以及其他BCR-ABL激酶抑制剂的开发，改变了慢性粒细胞白血病（CML）患者的生活。但是，大多数患者无法通过抑制激酶产生疗效。尽管抑制了致癌激酶活性，大量CML干细胞仍能存活，并且有假设提出它们通过BCR-ABL激酶非依赖性作用来存活。不幸的是，事实证明，针对于这种假设的研究具有挑战性，尤其在患者样品中，因为基因敲除后的固有选择要求。我们的实验室和其他团队已开发出能够诱导BCR-ABL降解的PROTAC。最近，我们与BrianDruker的合作研究中采用变构BCR-ABL的PROTAC，发现了CML患者干细胞不依赖于BCR-ABL蛋白，表明它们的扩散存在另一种机制，应该探索其他替代疗法。

FLT-3ITD在AML中的非激酶作用

关键FLT-3子域的内部串联复制（ITD）为已经得到验证的驱动急性髓细胞白血病的基因突变，但是临床试验证明恒定且完整的激酶抑制才能产生治疗效果。我们假设突变体FLT-3ITD的降解可能提供潜在的治疗方法，因为降解会导致完全且持续信号缺失。临床3期候选药物quizartinib转换成PROTAC后产生了一种化合物，尽管其减少了体外和纤维素中的抑制效果，但是其相对于quizartinib具有较强的抗增殖作用，该结果说明了AML中FLT-3ITD的非激酶作用。

TRIM24作为AML中的关键

与BRD4PROTAC的开发类似，PROTAC也被用于研究含溴结构域的转录共激活蛋白TRIM24。TRIM24配体IACS转化成PROTAC会生成有效的TRIM24降解剂。有趣的是，尽管IACS能抑制TRIM24与超乙酰化染色质的结合，但它不能诱导强烈的转录反应。但是，TRIM24通过VHL型PROTAC介导的降解在AML细胞中显著上调了肿瘤抑制基因，表明了急性期白血病的TRIM24依赖性。

BRD9在滑膜肉瘤中至关重要

已开发出极其具有选择性的BRD9的PROTAC来研究该目标在BRG1/BRM相关因子（BAF）复合物中的作用，使用该降解剂来确认滑膜肉瘤对与致癌融合蛋白SS18-SSX表达和SNF5的丧失相关的非经典BAF复合物的依赖性。有趣的是，由PROTAC介导的BRD9降解表明，恶性横纹肌样肿瘤也缺乏SNF-5，并依赖于含BRD9的非规范BAF复合物。这证明了也就是说，一旦丢失SNF-5，癌细胞就会重塑BAF复合物。最近也有关于BAF复合体的其他组成部分的PROTAC的报道。

FAK的支架作用对于细胞迁移而非扩散至关重要

鉴于使用粘着斑激酶（FAK）抑制剂进行治疗的患者未能存活到其临床前承诺的时间，因此Cromm等人（）将FAK抑制剂defactinib纳入了PROTAC来评估FAK降解对抑制作用的影响。细胞培养研究表明，尽管抑制FAK激酶不能阻止在伤口愈合实验中以及在跨孔实验中细胞迁移，但是降解FAK是可以的，强调了FAK的激酶非依赖性功能。有趣的是，这项工作和勃林格殷格翰公司的一项并行研究均未能在表型上证实shRNA导致的FAK耗竭的抗增殖作用。

基于标记的系统

为潜在的目标开发定制的PROTAC可能超出许多学术实验室的能力；因此，已开发出基于标记的方法来结合基因修饰和PROTAC技术。下面讨论最常用的两种PROTAC系统。

HaloPROTAC

HaloPROTAC系统利用HaloTag蛋白，一种工程性细菌脱卤素酶，可实现氯烷标记分子与目标融合蛋白的正交共价结合。VHL招募型和cIAP招募型的HaloPROTAC都被报道可诱导各种HaloTag融合底物降解，包括细胞质（ERK，MEK和GFP），核内体（VPS34和SGK3）和核定位蛋白（CREB1）。HaloPROTAC系统还为多个生物学系统提供了发现，如下所述。

PNPLA3在脂肪肝疾病中的作用

BasuRay（）等使用HaloPROTAC3在体内实验中降解HaloTag与含patatin样磷脂酶结构域的蛋白质3（PNPLA3）融合的融合蛋白。PNPLA3中的一个IM突变与非酒精性脂肪肝相关，其通过甘油三酸酯积聚到脂滴中导致脂肪变性。IM突变导致甘油三酸酯水解酶活性降低约80％，但是，令人惊讶的是，还原或非催化PNPLA3蛋白的存在是肝脏脂肪变性所必需的。PROTAC介导的IM突变PNPLA3的体内降解使小鼠肝甘油三酯恢复正常，从而提供了突变PNPLA3的累积与肝脂肪变性有关的有力证据。

WASH络合物形成的动力学

HaloPROTAC系统也已用于确认热休克因子结合蛋白1（HSBP1）是一个装配

Wiskott–Aldrich综合征蛋白和SCAR同源物（WASH）复合物的因子，在分类核内体中起关键作用。HaloTag的降解：在PROTAC洗脱过程中WASH融合蛋白和随后的HSBP1敲除的siRNA证明HSBP1是将CCDC53同三聚体重塑为WASH复合体所需的组装因子。这种方法突出了使用PROTAC可实现蛋白质水平的暂时控制，使具有挑战性的脉冲追踪实验变得可能。

dTAG

dTAG系统的工作方式与HaloPROTAC类似，但是F36VFKBP突变蛋白代替了HaloTag标记蛋白与目标蛋白融合。dTAG系统使用F36V选择性“凸点”配体，与免疫调节酰亚胺药物衍生物结合来招募CRBN，随后降解FKBP融合蛋白。该系统已显示可通过25mg/kg腹膜内（i.p.）注射进行体内实验。原理验证研究已表明dTAG适用于多种蛋白质，包括HDAC1，MYC，EZH2，PLK1和KRASG12V，该系统已被用来解决生物学问题，下面举例说明。

基底样乳腺癌细胞不依赖于MELK

先前使用shRNA沉默的研究表明，基底样乳腺癌（BBC）细胞依赖于母体胚胎亮氨酸拉链激酶（MELK）的表达来生存。然而，一项采用了选择性MELK抑制剂，CRISPR和PROTAC介导降解的深入研究发现了BBC细胞与MELK水平相关程度的不确定性。黄等人（）使用CRISPR基因编辑敲除了MELK，发现对细胞扩散没有影响。同样，MELK抑制剂也没有抗增殖活性。考虑到在选择和/或克隆程序中出现代偿性信号可能解释了他们的观察结果，他们还引入了MELK的dTAG版本代替内源性MELK，使MELK不断表达，绕过任何动力学代偿的出现。使用dTAGPROTAC可以快速有选择地诱导dTAG-MELK降解，尽管MELK快速丢失但对细胞增殖没有影响，证实了BBC细胞并不依赖于MELK。

胞质突变核蛋白对于白血病发生至关重要

Brunetti等（）使用CRISPR/Cas9基因编辑证明了突变核磷蛋白（NPM1）的重组，可以通过破坏核出口顺序抑制细胞增殖并诱导造血干细胞分化。这是通过破坏HOX/MEIS1转录程序而发生的，结果与HOX/MEIS1基因是造血的主要调节剂的假说相一致。为了进一步证实胞质NPM1的缺乏诱导了该表型结果，Brunetti等（）使用了dTAG系统来快速消耗NPM1（4小时内消耗85％）。产生了相同的表型结果，证实了胞质NPM1的缺失与HOX/MEIS1表达下调之间的直接关系。

HaloPROTAC与dTAG

HaloPROTAC和dTAG都是强大的方法，理论上可以同时使用，因为它们有正交性。但是，两者之间存在细微的差异，决定了在应用时会需要从两者之间选择更加合适的一种。例如，dTAG要求一个比HaloTag（33kDa）更小的标签（FKBP12F36V，12kDa）来整合到靶蛋白中，这可能有利于在拥挤系统中dTAG的使用，因为标签可能会干扰蛋白质-蛋白质相互作用。但是，HaloTag融合技术的商业可得性和其他多种用途使其成为完美的选择，例如，当某人希望既能研究蛋白质的亚细胞定位又能诱导其降解的时候。此外，HaloPROTAC系统没有显示出dTAG所观察到的“钩状效应”。而且，在HaloPROTAC中使用VHL配体时可以调控非对映异构体，并避免基于IMiD的PROTAC的相关的问题。

工作流程

要使用PROTAC系统，有必要从头开发能够靶向目标蛋白的PROTAC或者使用标签（如上所述）修饰靶蛋白以启用通过HaloPROTAC或dTAG降解分子。确实，用标记的靶蛋白进行初步研究可能对建立概念验证来开发针对内源蛋白的PROTAC是有利的。鉴于基因编辑的最新进展，在内源基因座处标记目标蛋白使其在无需过表达或开发其新的配体的前提下进行配体诱导的降解是相对比较容易的。图3中显示的是开发PROTAC的典型工作流程。很明显，工作流程始于选择要降解的目标蛋白。

Figure3.PROTACDevelopmentWorkflow

目标选择

一些理想的PROTAC靶标是（1）没有酶促功能且传统小分子无法调节的蛋白（2）除酶促活性以外还具有其他作用的蛋白质（例如FAK或BCR-ABL的支架作用），或（3）受抑制后会发生补偿性上调难以实现最大程度的蛋白质功能丧失的蛋白质。查看以前的敲除实验可能会很有用（例如表型全基因组CRISPR筛选或RNAi）或针对靶标选择期间特定的细胞类型依赖性以收集有关靶蛋白的信息。对有些蛋白质的抑制作用足以废除其所有功能，降解几乎没有增加生物学效果，但这些蛋白质可能很少。在这些情况下，PROTAC仍然可以在减少剂量和增加持续时间方面起到好的效果。更令人兴奋的是PROTAC可以将可药物治疗的蛋白质组扩展到任何可配的蛋白质。在观察到的约17,个蛋白质中，仅有10％-15％可成药的，还有更多被证明是可形成配位的，但许多此类小分子结合均没有功能。通过PROTAC转化来赋予生物学惰性配体活性的能力大大扩展了可药用蛋白质组。

PROTAC开发

随后，对已知靶标的配体的相关文献应进行彻底的考察。如果有合适配体，随后研究共晶结构或已知的构效关系可能揭示合适的用于连接的位置。此时，PROTAC转换可以开始，使用合成化学和药物化学来附加靶蛋白配体的连接子和E3募集元件。如果目标蛋白以前没有报道过的配体，或者报道的化合物具有可疑的结构，则可以启动针对目标蛋白的配体鉴定行动。或者，最初就使用HaloPROTAC或dTAG的方式可能更简单，我们建议使用多种链接器长度和组分来开发PROTAC，尤其是当合成方法允许模块化时。接头长度和成分可以产生深远的影响。例如，删除了乙二醇单元的HaloPROTAC没有诱导降解的能力，BCR-ABL用醚代替酰胺的PROTAC显示更好的细胞通透性，基于拉帕替尼的PROTAC可以是双重EGFR/Her2降解剂或选择性EGFR降解剂，具体取决于连接子的长度。当有PROTAC候选分子或细胞系中表达的标记蛋白可用时，至关重要的是首先确认它们确实会诱导靶标降解。通常，这是通过免疫印迹实现的，尽管质谱或流式细胞仪也可以使用，具体取决于靶蛋白的性质。迭代筛选可能是合成足够有效的PROTAC所必需的，或者可能需要探索几种标记方法和/或标记合并位点来达到最好的降解效果。我们通常建议PROTAC的初始处理时间为24小时，但动力学表征通常表明降解发生的时间更迅速。最近，已开发出用于研究细胞中PROTAC的定制技术，这些技术可能被证明有助于指导其发展。候选物的合成和测定通常是

PROTAC的限速步骤，取决于可用于目标的化学物质的质量。从特征明确的小分子开始具有明显的优势，并且随着Target计划，PROTAC开发的速度和便捷性无疑会增加。

PROTAC验证

当一个PROTAC被定义后，在其作为工具被使用前通过对照实验仔细表征其降解至关重要，通过qPCR来确认蛋白质损失发生在翻译后水平，而不是通过mRNA的降低发生的。一些小分子诱导它们的靶蛋白显著降解，但实际上发生在转录水平。确认通过UPS发生降解也至关重要。为此，可将细胞与下列UPS的药理调节剂共同处理。我们尤其建议与蛋白酶体抑制剂（埃波霉素或硼替佐米）进行共处理，这种共处理可以将蛋白质水平保持在未经处理的水平。此外，与NEDD8活化酶抑制剂MLN-（pevonedistat）的共处理可以确认活性的E3连接酶是否参与降解（Cullin连接酶需要酶联化才能发挥作用）。由于这些控制化合物的毒性，因此通常需要使用最短的培育时间并要求显著的降解。

重要的是，应用小分子的降解允许使用非活性类似物作为对照化合物。这对于使用源自抑制剂的PROTAC发现新的生物学内容至关重要。通常，可以通过离散修饰E3连接酶配体结构并破坏其活性来产生失活的PROTAC；所得分子无法诱导降解，但在抑制靶标方面与PROTAC一样有效。我们赞成使用VHL受体配体，用于仔细研究抑制作用和降解作用，因为VHL配体上立体中心的简单反转会产生具有相同抑制活性和药理特性（例如细胞渗透性）的化合物，使其能够充当完美的对照组。立体中心的倒置也可以用来生成非活性化合物作为MDM2招募型PROTAC的对照组。通过去除羰基或酰亚胺官能团的甲基化，有可能损害CRBN招募的IMiD配体；但是，这也同时调节了其理化性质。使用IMiD类似物时必须小心，因为它们仍可能诱导与IMiD病理生理学相关的锌指新底物降解。非活性的PROTAC是重要的实验对照组，可以确认或否定PROTAC的降解机理，因为仅配体结合就会破坏靶标的稳定性而不必募集E3连接酶，例如疏水性标记或SERDs。此时要进行的另一项可选实验是对PROTAC诱导的效果进行蛋白质组学表征，例如质谱或反相蛋白质排列，可以获取PROTAC的选择性数据。定量蛋白质组学是一种功能强大的工具，可以识别除目标蛋白以外的其他蛋白，这些蛋白可能会被PROTAC降解。当然，这可能是生物学上的靶蛋白丢失，例如BRD4降解时c-Myc的丢失，也可能是药理学上的，例如基于福雷替尼的PROTAC意外的降解了p38α。

PROTAC的优缺点

优点

催化作用机理：因为PROTAC通过行动驱动而不是占用驱动的机制，它们充当了选择性蛋白质降解的催化剂，一分子PROTAC能诱导多数靶蛋白分子的泛素化。最近的研究表明，只需要占用10％的E3连接酶就能够有效地导致目标降解，尽管共价修饰了E3，创建了永久重组的E3连接酶。通过使用低亲和力配体或与竞争性激动剂共同处理，靶向配体一侧的占用也已被证明是有限的。PROTAC的这种催化性质模仿了RNAi。

小分子特性：它们的小分子性质使PROTAC与抑制剂一样易于在实验中使用。PROTAC的应用不需要专门的转染试剂和培养条件。确实，除了基于标计的系统，PROTAC不需要基因修饰系统，允许了在完全内源性的系统中进行考察。这允许使用相同的方法直接比较降解与抑制，从而增强了对蛋白质功能的生物学了解，并避免了转染试剂自身作用或RNAi作用对复杂生物系统的干扰。

另一优势是由于其小分子性质使得PROTAC可控制化合物的浓度，并能够定量控制蛋白质水平。PROTAC可以用“模拟”方式在0％–％之间调节蛋白质水平而不是使用“数字”开关，例如基因编辑。这可能对于解决在疾病部分过度表达但在正常或健康部分必不可少的蛋白质特别有效。经过剂量反馈实验，有可能以非最大剂量诱导降解进行治疗，将过表达的蛋白质含量恢复至正常水平。

时间控制PROTAC可以在精准的时间控制下调控蛋白质水平（仅需1小时即可观察到降解），允许以一种许多其他技术不可能做到的方式研究急性蛋白质损失。这可以防止在选择过程中关键蛋白缺失后像各种RNAi技术和CRISPR/Cas9一样产生生物学补偿。常见的CRISPR技术是采用同源定向修复（HDR）在受干扰的基因位置上插入GFP或抗性基因，从而可以选择成功编辑的细胞。虽然很强大，但这种持续多天的选择可能选择出具有替代途径的细胞群体，这些途径可驱动增殖或者逃避特定蛋白质损失引起的问题。PROTAC能够快速消耗整个细胞群中的蛋白质，提供了一种在天然环境中考察蛋白质的功能更准确的方法。

此外，PROTAC的撤回可以在蛋白质重新合成允许的范围内快速恢复目标蛋白质水平。这提供了可逆性用来进行美妙的实验，例如上面针对WASH复合体的内容。虽然化合物洗脱后，某些PROTAC可能在细胞中存在并继续降解，但是同时添加过量的E3连接酶配体可以竞争性地防止这些降解。

可移植性：PROTAC方法的另一个好处在于其可移植性。通常，如果PROTAC诱导泛素化并在同一个系统中降解蛋白质，它就可以被更广泛的应用，只要新系统具备符合要求的成分（E3连接酶等）。这使得快速筛选不同细胞类型中蛋白质的作用，而无需对其基因修饰成为可能。此外，它可以在不适用其他技术的情况下研究蛋白质，例如上面讨论的无法培养的患者细胞和CML干细胞。

可移植性的另一个优势在于向体内实验以及临床的过渡。在体内应用PROTAC不需要对动物进行基因操作，从而可以更快地进行实验和探测不受干扰的系统。虽然PROTAC可能需要优化其理化特性才能应用到体内实验中，还是有许多PROTAC在体内起作用的例子，包括哺乳动物和非人类灵长类动物。尽管PROTAC有潜在的药代动力学问题，它们的小分子性质和可移植性使其比其他技术更简单直接的起作用。重要的是要注意，PROTAC常常表现出比其分子量预期更好的药代动力学特性。实际上，是有可能开发具有人类口服生物利用度的PROTAC的，最近，ARV-和ARV-的1期临床试验报告证实了这一点，每天口服一次，可达到临床前研究中观察到的有效效果。

缺点

发现阶段：尽管有上述所有优点，但对于PROTAC而言，它们并非没有挑战。一个主要缺点是PROTAC开发的时间与设计并达成siRNA或指导RNA相比可能会比较冗长。如图3所示，PROTAC不仅需要目标蛋白质的配体，而且还需要其可以转换成PROTAC。这可能是一个耗时的过程，涉及大量的合成化学和药物化学。基于标签的系统（HaloPROTAC和dTAG）绕过此开发阶段，但也丢失了PROTAC系统在可移植性和不需要基因操作方面的优势。

脱靶效应：与其他技术一样，脱靶效果是存在于PROTAC中的。经过PROTAC治疗后，使用蛋白质组学定量蛋白质（包括低水平表达的蛋白质）是评估PROTAC的脱靶效应的有力工具。即使已知募集原件的选择性，蛋白质组学也可以揭示出令人惊讶的新PROTAC底物，这很可能是由于问题蛋白质和E3连接酶的蛋白质-蛋白质相互作用的加和效应所致。理论上，配体与E3连接酶的结合可能会干扰内源性底物的结合。幸运的是，要稳定其内源靶标HIF-1α，需要比通常使用VHL的PROTAC高得多的配体浓度；但是，脱靶效应可能在底物表征不佳或未知的其他E3连接酶中更为严重。CRBN招募的PROTAC的脱靶效应必须进行非常仔细的评估，因为IMiD组分单独或掺入PROTAC都会诱导锌指CRBN新底物降解。

钩状效应：PROTAC和其他双功能分子表现出奇特但完全能被理解的现象，即较高的浓度并不总是会产生更好的效果。这种所谓的“钩状效应”是由于在高PROTAC浓度下形成非有效二聚体，而不是降解所需的有效三聚体所导致的。这引起有关药代动力学/药效学（PK/PD）关系和给药方案的方面的担忧。但是，应该注意的是，E3和目标蛋白之间有利的蛋白-蛋白相互作用似乎增加了在观察到钩状效应之前可以使用的最大浓度。

并非所有蛋白质或亚细胞位置都适合：由于PROTAC仍然是新兴技术，它还没有被证明可以适用每种蛋白质类别或亚细胞系。胞质和核蛋白可以被常规的降解;某些E3连接酶可选择性降解核蛋白。已经有受体酪氨酸激酶降解的几个例子被报道了，但是没有报道过单程跨膜蛋白的例子。HaloPROTAC已经被用来降解内体膜局部的蛋白质。

Figure4.DiagramofaTypicalMammalianCell,DenotingLocationsofProteinsthatAreSusceptibletoPROTAC-MediatedDegradation

与其他技术的比较

在本节中，我们将简要比较PROTAC与其他目前能够研究蛋白质功能的技术。

讨论某种技术可能更适用于某种应用。

RNAi

RNAi已在现代生物学研究中无处不在，也是研究蛋白质功能的绝佳工具。PROTAC在许多方面都可以用作siRNA的化学等效物，它们之间的差别很小。PROTAC比siRNA更具有实验性的优势，因为PROTAC实验中不需要使用转染试剂。对于大型目标库，siRNA可能是有利的，而对于研究一种特定的蛋白质，PROTAC则更具有优势。两种技术都是“敲除”的方式，并具有潜在的脱靶效应，但是鉴于蛋白质组学通常用于表征PROTAC，其脱靶可能更容易被发现。与RNAi相比，使用PROTAC可能还可以实现蛋白质总水平的降低，特别是对于长寿命蛋白，这是因为PROTAC靶向蛋白质而不是阻止其附加表达。

基因编辑

CRISPR/Cas9和相关基因编辑技术无疑是在长期蛋白质消耗的实验中非常有效的。但是，这种需技术既耗费时间又允许了生物学的代偿。PROTAC在动力学方面具有优势，可以研究快速的蛋白质损失来加快工作流程，并可能提供有关内源系统的更多细节。基因编辑可以提供蛋白质敲除同时基因都需要被编辑，这在多倍体细胞中具有挑战性，而PROTAC因为在转录后起作用，所以可以使用。

结论

本文中，我们通过举例和对该技术的说明来介绍了PROTAC的强大功能，这些功能可作为探测生物系统的工具或者潜在的治疗方法。这种有针对性的蛋白质降解方法为实验生物学工具箱添加了新工具，结合了RNAi和小分子抑制剂的优势，并为现有工具提供了正交性补偿。我们希望PROTAC成为蛋白质功能研究的支柱，我们相信它们使我们能够解决当前棘手的生物学问题。例如，PROTAC的可逆性和动力学优势提供了比其他方法更高的分辨率来暂时控制蛋白质水平。这提供了机会来比较蛋白质的快速损失与缓慢损失，并可以研究重新引入该蛋白质带来的影响。在规定的时间内消耗蛋白质，然后以转录所允许的最快速度将其恢复到内源水平的能力在蛋白质复合物研究中很有用，特别是在遵循关联顺序的情况下。随着PROTAC技术的不断成熟，前文中讲述的缺点将变得不那么严重。例如，当前使用PROTAC的最大挑战是开发阶段的时间过长。随着我们不断增强对UPS，有效PROTAC的需求以及靶标蛋白质配体的了解，开发阶段将显著缩短。同样，随着其他E3连接酶配体的出现，成功开发PROTAC的可能性也随之增加，并且适用于更多的细胞位置。

本次的文献分享就到这里，建议在了解了UPS系统，Halotag，dTAG，WASH，

RNAi以及CRISPR/Cas9等相关基础的前提下阅读学习。(*^_^*)

佳家点评：小分子药物嘛，“道路千万条，能吃第一条！”PROTAC作为百年一遇的药化范式变革确实是巨大的突破，但能不能单挑利宾斯基RO5个人表示怀疑，且临床数据还远不够支持这个领域真正已经取得成功，值得高度